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[求助]我的293cell怎么都漂浮起来了？
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开始时我在塑料瓶中大量养293cell，之后我就把15瓶293cell分别用胰酶消化，然后再把所有细胞收集混在一个瓶子里，之后再吹打混匀后分别铺在8个10cm平皿上，继续培养。在瓶子里的293cell密度一般都有80％左右了，状态一般。但是第二天来看细胞时，所有平皿中的cell都漂浮了起来。不知怎么回事？
但在铺平皿时出现了一个意外情况，在把细胞从瓶子传到平皿中，培养了大概3hr后，由于培养箱CO2浓度不够了，于是我就把平皿转移到下面一个培养箱里继续培养了。当时我的动作很轻的，尽量不晃动细胞。
我现在怀疑第二天细胞漂浮起来是不是和我在3hr后移动了细胞相关。因为传代后4hr内，细胞是处在贴壁生长的关键时期。
所以想请教各位，细胞漂浮起来的关键原因是什么呢？在养293cell的时候应该注意些什么？先谢过了！
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最新回复
pengke1983 (2012-7-27 12:13:47)
QUOTE:
是不是瓶子的问题?zranqi_1 (2012-7-27 12:14:04)
我的问题跟你差不多
传代之后换了个新的盘子就贴得不好了，在原来盘子里的还挺好
不知道什么原因
最近快被293T折磨死了
831226 (2012-7-27 12:14:22)
我觉得还是和你3hr的时候，移动培养皿有关。因为293着壁能力不强，这一点在用胰酶消化293时表现得很容易脱离。如你所说4hr之内使着壁关键期，所以我想是‘这个缘故
wmp1234 (2012-7-27 12:14:50)
我也怀疑很可能是我移动了培养皿的原因。瓶子应该没什么问题，因为都是新开的，以前没有用过。
至于楼上战友所说的问题，换了个盘子就细胞贴得不好了，我怀疑是不是有可能，一是由于你胰酶消化时间过长，造成后来细胞很难贴壁；二是你传代前细胞太稀了的缘故。一般都当细胞长到80％左右就传代，太密了也不是很好。
2541 (2012-7-27 12:15:12)
293贴壁性不是很好，最好用多聚赖胺酸包被一下 （培养闽加多聚赖氨酸，37度孵育半个小时，然后吸掉．多聚赖氨酸可以反复用的，所以加多一点也无所谓，可以回收）
XYZQ (2012-7-27 12:15:31)
293细胞其实是很容易培养的,我一直养着,从来没有这种情况.如果你怀疑跟移动培养皿有关系,你可以下次培养时用一个小瓶作对照嘛.
说说293培养的一些技巧:
胰酶消化很关键,一定不能消化过度,这样细胞养着养着就会出现不贴壁的状况.因为293本来贴壁就不好.但也不能消化不够,这样细胞就会抱团,最后还是会脱壁.
我是这样消化的:倒出原来的培养液,加2-5ml胰酶洗一下,倒出.再加一点一酶,洗一下.......
ALALA (2012-7-27 12:16:41)
如楼主所言，我也经历了2个月的痛苦折磨，293复苏很好，但一传代就不贴壁死掉了。为了找出原因，反复进行复苏培养，细胞种子所剩无几。起初怀疑培养液pH值过碱的问题，后来用上了HEPES，呵呵，消化的时候任你如何吹打，培养液颜色始终不会像以前那样容易变紫。不过293细胞还是死～ 后来怀疑培养瓶不干净，可我们加倍洗涤的瓶子仍然培养不出293～再后来怀疑到细胞种子上了，可怀疑又怎么样，已经浪费好多支种子了，难道还要我
去美国再买新的不成？不过冷静下来仔细想想，很多次都是复苏OK传代死，应该不是种子的问题！那么就是....就是消化液的问题——胰酶？！！！前几天费了不少功夫配了新的D-HANKS，加入胰酶，调pH值后4度过夜；今天传代前再度调pH值，进培养间过滤，分装。消化方法也有所改进，为了防止过度消化损伤细胞，我们向75cm的培养瓶中加入1ml胰酶，镜下观察到细胞收缩后立即竖起培养瓶，移去胰酶，这时再加入4ml 10％血清培养液中和残存的胰酶，吹打。拿到镜下观察，呵呵，吹的很散，而且有的细胞没有完全变圆，还有突起，说明这次没有出现过度消化。另外我们为了增加细胞的贴壁效率，每瓶只加了刚好覆盖瓶底的培养液（大约是2.5ml）。结果第二天细胞贴壁非常好，24h就伸展完全，看来是改良的消化方法和新胰酶起作用了。不过....不过什么原因，传代的细胞居然被污染了，一波刚平，一波又起，养细胞真是不容易。
希望我的经历能对楼主有所帮助。有问题咱们相互探讨一下吧，我是做293腺病毒转染的。
KGZ564 (2012-7-27 12:17:15)
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如此的过程一定会很长，细胞没有及时得到培养，因而影响了细胞的活力。
wu11998866 (2012-7-27 12:17:40)
293T是不太容易贴壁的，消化是很关键的，以前我试过不用胰酶消化，也能将细胞吹下来的，但碎片较多，后来适当的降低胰酶浓度就可以了，我是用一管PBS加一管胰酶一起作用，细胞即能消化的很好，第二天贴壁也很好的
TAT (2012-7-27 12:18:08)
baidukk (2012-7-27 12:18:27)
本人也做过一段时间的293细胞培养，当时是用来扩增腺病毒的。看了楼主的描述，我觉得不贴壁与你3小时后的扰动关系不大。我倒是觉得你种细胞的浓度太大。为什么要将15瓶的细胞收集起来再分别种于8个培养皿呢？浓度太大了。要知道293长到一定程度（>80％）的时候细胞的特性会发生变化。我一般是将一瓶细胞悬浮，分别种于于2-3个培养皿中，然后让其生长到80-90％满，加入病毒原液。等到所有细胞变圆飘起就说明扩增过程完成了。这样培养293在转染前的状态是最好的，对病毒扩增最有利！不像你的方法，一下种那么密，就算都能贴壁，那时的细胞密度已经接近80-90％，况且细胞都是才传代的，状态肯定没有稀释培养法好。另外，给你个重要的提示：293细胞很容易吹打下来。不需要使用胰酶，反复吹打即可。长到80％的细胞更容易吹下来！胰酶对293细胞的伤害很大，即使你的消化时间很短。希望对你有用。
shenkunjie (2012-7-27 12:18:47)
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