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[求助]帮我看看我的荧光免疫组化图片

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-7-30 12:46    作者: KGZ564    来源: 分析测试百科网

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我是第一次做荧光免疫组化,结果不理想,希望各位老师能帮我分析分析.
首先介绍一下我的操作步骤:用甲醛溶液固定细胞后,放在4度冰箱备用.
1.取出细胞爬片在室温下解冻,PBS冲洗3遍*3分钟,
2,加0.1%Triton后放入4度冰箱作用30分钟.
3,PBS冲洗2遍*5分钟.5%BSA封闭液室温20分钟,加一抗(浓度为5ug/ml),4度过夜.
4.4度PBS冲洗5遍*3分钟.
5.加二抗(FITC标记,浓度为5ug/ml),37度40分钟
6,PBS冲洗6遍*5分钟.
其中第5步和第六步均避光处理.
7.缓冲甘油封片,荧光显微镜下观看.结果如图
我想问问,为什么背景颜色是绿色的?可以看到阳性结果吗? 是胞浆着色还是胞核着色?怎样才能降低背景颜色?谢谢各位的帮忙!!呵呵!!!
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最新回复

  • chuntian1983 (2012-7-30 12:46:39)


    1、必需设立阴性对照组，如果有阳性对照更好。2、根据阴性对照的情况，如果阴性对照总出现荧光，加二抗前也要封闭。3、如果想让结果更有说服力，更漂亮，要用红色的荧光染核。我有用Alex555标记的二抗配合Hoechst33258做的细胞免疫荧光化学的照片，如果需要的话，我可以传给你。

  • whitesheep (2012-7-30 12:46:55)


    我一般使用室温2小时，如果用37度，非特异荧光明显。

  • KGZ564 (2012-7-30 12:47:33)


    阴性对照组是只加二抗吗？

  • KGZ564 (2012-7-30 12:47:54)

    1、必需设立阴性对照组，如果有阳性对照更好。2、根据阴性对照的情况，如果阴性对照总出现荧光，加二抗前也要封闭。3、如果想让结果更有说服力，更漂亮，要用红色的荧光染核。我有用Alex555标记的二抗配合Hoechst33258做的细胞免疫荧光化学的照片，如果需要的话，我可以传给你。

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    谢谢你了,
    我已经作了好几次了,还是没有什么进展 ,你可以把你的图片传给我看看吗?

  • ladyhuahua (2012-7-30 12:48:14)

    你的抗体特异性好吗？可以先用WB来检测一下抗体的特异性，背景高有可能是因为加入抗体量太大，可适当调整稀释比例。然后，可以在washing用的PBS中加入一点tween20之类的去垢剂，提高去处非特异的能力
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