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[求助]悲痛中，细胞死了，大家帮我看看是什么原因~
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好郁闷，好伤心呀~~
我用了2个多星期把形态不好的细胞传好了~
前天上午传代的时候出了点问题，消化的时候感觉细胞核都不在了样，中间空了，很奇怪，不过细胞还是长了些，中间基本满了~
我让它们长了36h后，今天早上传代，我把2瓶传成1瓶，想增加细胞量，可刚刚我去看细胞，感觉营养液变碱了，但没有浑，只有很少细胞贴上去了，很多细胞都是圆的，根本没贴上去~~我传代的时候消化完细胞都是好好的。郁闷呀~~大家帮我看看是什么原因~
我消化的方法是：75ml的瓶子，加1mlPBS，80ul10倍的胰酶，消化到细胞分开，倒掉大部分胰酶，继续消化到细胞变圆，快掉下来的时候，加营养液停止消化~~
我吹打的很轻，几乎没有产生泡沫~
营养液我放到温箱里观察了，细胞也会继续观察有没有污染~现在看来还没有~~但是细胞瓶里的营养液感觉变碱了，之前我加进去的时候都是橙红的，现在变成有点紫红了~~~
请大家帮我分析分析，找到问题我才敢重新复苏一瓶呀，要不又遭了我就惨了~~就没有细胞了~~
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最新回复
pengke1983 (2012-7-30 13:35:00)
chuntian1983 (2012-7-30 13:35:17)
你可以继续再等待几个小时，比如到晚上或过夜后再观察细胞，如果细胞贴壁还很少，则说明细胞活性有问题。
培养基澄清还是浑浊的？根据目前情况分析，最可能是细胞培养基有问题，因为你上午才加入的培养基，隔了几个小时就变碱性，而细胞量又不是太多。培养基是自己配的，还是买的？如果自己配的，有没有进行检测pH值？因为细胞在7.2环境中生长最好。
消化的时间不要过长，过头也会导致细胞活性降低。
另外还有注意操作的无菌观念，即使培养基是干净的，如果操作过程中不注意，也可能会导致细胞污染。
蒲公英 (2012-7-30 13:35:35)
细胞也在观察中~~反正细胞肯定是死翘翘了~~看看培养液变色不~~
我打算再观察几天，然后涂个片看看~~
然后我打算把东西都再灭一次，再换隔壁实验室统一配制的MEM，重新复苏细胞看看~~
还在伤心中~~~
想着实验进展不下去~~更郁闷~~
lixi559 (2012-7-30 13:35:53)
lixi559 (2012-7-30 13:36:17)
Sorry, I forgot, did you add 10%FBS and L-Glutamine. I think you need these.
newway (2012-7-30 13:36:33)
培养液变碱：1.传代时间还短，过夜或十二小时后再看；2.你的培养液以前用正常吗？是变碱吗？培养瓶里的和溶液瓶里颜色正常就有点差异的；3.别人的培养液有没有变碱？有的话培养箱CO2浓度低。
蒲公英 (2012-7-30 13:37:00)
我肯定是加了10%的的血清的呀~~
营养液以前用都没有问题的~~
现在是传代后28h，营养液没有混，颜色也正常，还有有部分贴了的细胞在生长，只是形态很不好~
我们这都用的是没有充CO2的培养箱，大家都可以培养好~~
我现在初步估计是消化过头了~
气泡 (2012-7-30 13:37:21)
细胞已经分开了，就不用继续消化了啦！！培养液向碱性发展，我想可能是瓶盖没扭紧吧，加上细胞代谢慢，就这样了。同意是，消化过头的问题。
sunnyB (2012-7-30 13:37:41)
解决方案
我想楼主一定是从年底开始养的细胞,没有经历过气温较高的情况。
胰酶的活性由两个因素决定:温度,PH值.
由于气温的升高,酶的活性呈指数上升,因而不缩短消化时间,不降低酶浓度的情况下在原有的时间长度内细胞被过度消化,细胞活性大大低,不能产生正常的酸性代谢产物故培养基PH上升颜色变紫。
培养基经过一段时间的放置,PH值降低,颜色变浅,也不利于细胞的生长,因而受伤的细胞不容易恢复状态,不能产生正常的酸性代谢产物故培养基PH上升颜色变紫。
所以在天气变热或者气温下降后,及时调整胰酶的浓度和消化时间很必要,对于贴壁细胞的培养是一个需要掌握的技巧.
u234 (2012-7-30 13:38:01)
我的情况同楼主相似，我是一传三，将消化好的细胞平均分成三分，然后一份种在原来的瓶子里，另两份种在新的培养瓶中，结果两个新瓶子里长的不好（同楼主描述的相似），旧瓶子的反而长的很好，条件都是一样，就是培养瓶只是新旧问题，差别怎么这么大呢，想不通（？）
guagua (2012-7-30 13:38:21)
楼上的战友，你所说的情况我以前碰到，请教老师，说是母瓶的细胞没有充分消化，故吹打时悬浮细胞数目较少，从而两个子瓶的细胞长的 不好
yueban-1147 (2012-7-30 14:45:05)
我估计是培养基PH的问题,你这次的培养基用了多长时间了?肯定超过一个星期了,你们又没co2,再加上天气那么热,培养基很容易变质或PH产生变化的,再调一下试试
milkdog (2012-7-30 14:45:58)
严重同意楼上多人的说法，亲历过，重新测定一下pH，校正一下培养箱CO2
milkdog (2012-7-30 14:46:26)
严重同意楼上多人的说法，亲历过，重新测定一下pH，校正一下培养箱CO2（对不起，忘了，你们没有二氧化碳的，那就尽量用小瓶分装配置的培养液，尽量保证pH值向7.2靠拢）
dog002 (2012-7-30 14:47:31)
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我觉得我消化的挺好的，因为这个细胞很好消化，不过也不排除你的解释，因为好像没有别的原因了。
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