[求助]请大家帮我确认一下Brdu免疫荧光步骤

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-7-30 15:27 作者: 00无名指00 来源: 分析测试百科网

做了几次Brdu的免疫荧光，总感觉效果不太好，所以我想是不是步骤哪里出了问题
1用4度预冷(是不是应该加热）PBS洗3遍
2用4度预冷甲醇固定大概30分钟，PBS洗3遍
3用0.2%Tritonx-100通透10分钟，PBS洗3遍
4用1NHcl变性大概40分钟，PBS洗3遍
5用5%羊血清封闭30分钟，PBS洗3遍
6加一抗(1:50)置于湿盒中，4度过夜
7第二天，用PBS洗3遍，每遍10分钟
8用二抗室温孵育约2小时(避光）
9照相

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00无名指00 (2012-7-30 15:27:21)

真的是很想哭哦，我们实验室没有人做我这个，书上也找不到完全符合的，难道大家就忍心看我就这样浪费药品啊。
KGZ564 (2012-7-30 15:27:46)

我没做过不是很懂，提点意见
1 血清封闭后不应该洗吧
2，第一步应该是暴露抗原应该是加热吧。
这里有一份说明书，你看看。
cuturl('http://www.ihcworld.com/_protocols/antibody_protocols/brdu_accurate_chem_sci.htm')
33号 (2012-7-30 15:28:05)

我觉得你的这个过程有点问题！
bananapeople (2012-7-30 15:28:33)

你的BRDU是怎么配的，能告诉我一下吗
00无名指00 (2012-7-30 15:29:01)

confocal图1

54642715.jpg
00无名指00 (2012-7-30 15:29:20)

下面这张是上面的普通confocal扫描（忘了准确表达）

15242379.jpg
00无名指00 (2012-7-30 15:30:10)

其实我也不知道发哪些图上来，大家帮我看看非特异染色，顺便告诉我怎么看？还有没有荧光那张，是不是正常情况，若不是，告诉我可能哪个步骤出问题了。谢谢大家，谢谢版主！
00无名指00 (2012-7-30 15:30:32)

似乎图也没有发好，好小，好像看不清楚，不知道怎么弄那种，可以用鼠标控制大小的，如何上传，谢谢。
00无名指00 (2012-7-30 15:31:24)

取Brdu0.05g,加无血清培养基5ml,这样就配成了10000ug/ml的原液,我按照100ug/ml标准添加,就是每ml培养液中添加10ul原液.
00无名指00 (2012-7-30 15:31:57)

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6035153')这张是用荧光显微镜看的图，请大家帮我看看．
00无名指00 (2012-7-30 15:32:51)

具体来讲，我感觉可能主要是第３步和第４步可能不行，也就是说用0.2%Tritonx-100通透（有必要通透么）之后，用1NHcl变性（室温）大概40分钟，问题应该出在这里，因为大家可以从我上面荧光显微镜图中看得到在比较亮的细胞下面还有很多不是很亮的细胞，我做的是爬片，除了细胞可能的重叠外，我自己认为可能真是变性这步没有做好．