[求助]MTT的问题！

最新回复

• zhezhe (2012-7-30 17:02:42)

  各位看帖子的高手好
  我做MTT的预试都做了一个半月了，可总是不出结果。
  主要问题是加入MTT孵育4小时候后产生的颜色就像是加了DMSO溶解的颜色。镜下观察看到的甲瓒颗粒很少。
  请各位帮我看看是那里的问题。
  1.细胞数：2乘10的6次方。
  
  ______________________________________________________________________________________________________________
  
  首先未明白：你的细胞数目是每ml，还是每孔内的细胞数？文献大多要求做mtt时孔内细胞数达到1×10的5次方，个人认为这取决于你的细胞大小，不必拘泥陈规，文献只是常规。

• zhezhe (2012-7-30 17:03:30)

  实验孔，对照孔，空白对照孔，各设3个复孔：
  实验孔每孔180ul,加入20ul刀豆蛋白A(5ug/ml),对照孔加入200ul细胞，空白对照加入
  200ul培养基
  2.孵育68小时，加入MTT20ul后孵育4小时
  
  ————————————————————————————————————————————————————————————————
  
  其次，你的细胞形态大小、传代时间，就是它们的增殖速度如何，这决定你加mtt前的培养时间，不知你是否中间换液，200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
  
  另外，有一种可能就是你接种的细胞数目太多，到你加mtt时，由于营养等原因而导致细胞状态差问题，或是你的细胞本身状态问题，因为mtt是在线粒体内的酶作用下还原反应生成结晶的。
  个人拙见，仅供参考

• tianmei001 (2012-7-30 17:03:48)

  
  我对MTT也不是特别通，但我做了几次没有遇到你的问题，不过咱们的步骤稍有不同，不知道是不是这些原因：
  1、加MTT孵育4小时后，我是吸出所有的液体，然后加DMSO；
  2、用DMSO应该采用490-630波长测OD值；
  3、我的细胞浓度没有你用的那么多，大约是10*5，细胞太多了是不是在MTT及DMSO的量上有变化？不过我觉得这个不是关键。
  其他实验步骤基本一致，你看看对你是否有帮助。

• lixi559 (2012-7-30 17:04:08)

  
  我的MTT很熟练，没有出现过你说的问题，建议：
  1 新配制mtt，过滤
  2 加MTT孵育4小时后，我是吸出所有的液体，然后加DMSO，残留蛋白吸附mtt
  3 我做贴壁细胞，每孔2000个，100微升可以做72小时
  4 全部过程注意无菌，勤镜下观察，特别是对照孔，可以知道细胞状态如何

• any333 (2012-7-30 17:05:03)

  各位看帖子的高手好
  我做MTT的预试都做了一个半月了，可总是不出结果。
  主要问题是加入MTT孵育4小时候后产生的颜色就像是加了DMSO溶解的颜色。镜下观察看到的甲瓒颗粒很少。
  请各位帮我看看是那里的问题。
  1.细胞数：2乘10的6次方。
  ：我这里一般是10^5/well
  实验孔，对照孔，空白对照孔，各设3个复孔：
  ：空白设一个就够了，有条件的话，实验组都可以做5个复孔
  实验孔每孔180ul,加入20ul刀豆蛋白A(5ug/ml),对照孔加入200ul细胞，空白对照加入
  200ul培养基
  2.孵育68小时，加入MTT20ul后孵育4小时
  ：你的mtt是什么浓度的？书上一般写5ug／ul，但我一般加50ul，2ug／ul的。
  因为发现5ug／ul的很难溶，也难配。
  3.1000rpm离心，吸出150ul上清。加入150ulDMSO后混匀
  ：如果是帖壁细胞，我是倒扣96孔板，用吸水纸吸净，再用pbs洗1－2次，再加DMSO，并吹匀
  4.570-630双波长测OD值
  ：我用的是490和570两个波长的。
  
  还有就是雌雄老鼠对实验结果应该没有影响吧？是不是我的孵育时间（68小时）过长了导致细胞状态不好？
  ：68小时确实长了点，我最多48小时
  请各位一定要帮帮忙！

• ha111 (2012-7-30 17:05:20)

  
  你做的是不是脾细胞的淋转实验啊，我做过，加conA的话，会引起脾细胞增殖，72小时后，应该细胞挺多的，一簇一簇的。

• HPLC使者 (2012-7-30 17:06:08)

  
  我也有几点搞不懂，其实脾细胞在体外代谢挺慢的，照理说培养72小时应该没有问题，中途可以不换液。另外，淋巴细胞体外增殖96孔板每孔是要20万左右的细胞的，我碰到的问题是：ConA组的OD值也没有明显变化，请honvey老师介绍一下，你用的培养基，ConA的终浓度，培育多少小时？谢谢！

• u234 (2012-7-30 17:06:28)

  请教各位,我是做NK活性检测,怎么做了几次,脾细胞没找到,郁闷中. 我做脾细胞悬液的步骤: 1 无菌取脾,用镊子撕碎,200目筛网过漉
  　 2 用D-H anks 洗２次，离心　1000转，１０分钟
  　　　　　　 3 0,5 ml 灭菌水２０秒，裂解红细胞
  　　　　　　　４　ＤＨanks液８ml　，离心1000转，１０分钟，１ml完全培养液重悬．
  　　　　　　请问，问题出在哪里？

• lixi559 (2012-7-30 17:07:16)

  
  楼上的那位，你做NK活性检测，是用小鼠吗？
  我觉得无菌取脾后，用镊子撕碎是不是对脾细胞损伤太大了？用针芯在200目铜网上研碎就可以了。
  个人浅见，仅供参考！

• HPLC使者 (2012-7-30 17:07:34)

  
  取脾细胞我们是这样操作的。小鼠断头，尽量放干净血。在冰板上放一小皿，加入约5毫升D-hanks,取出脾脏，放入小皿中，用小剪刀剪碎，然后用针芯研磨，过虑网离心，出去大的组织碎片。加入红细胞裂解液，去除红细胞。再离心洗两遍。
  另，回答hitomy 的问题，Con A组5ug/mlCon A，OD值与对照组相比升高约2－4倍，有时候高达5倍。看刺激程度。培养72小时，不用换液。

• any333 (2012-7-30 17:08:06)

  
  我制备脾细胞悬液的过程和楼上说得差不多，但是在做mtt时，加入DMSO后，颜色没有明显变化，孵育半小时后，颜色略变紫，即使有时变紫了，调零孔（培养基）也一样地变紫，为什么？象楼上说“OD值与对照组相比升高约2－4倍，有时候高达5倍”，那么对照组的值0.1以上的话，那ConA组要达0.3－0.4，好象很高？脾细胞好象不好养，我当天用台盼蓝看时活细胞达95％以上，四五天后再看都是死细胞了，中间换过一次液的，培养基颜色也有变化的，说明还是有代谢的，请各位老师帮帮忙，我的mtt 值老是很低，为什么？

• any333 (2012-7-30 17:08:41)

  补充一下，我96孔板，每孔放入5×105个，当时台盼蓝检活细胞大于95%，做mtt时就老做不好，谢谢了！

• 园丁## (2012-7-30 17:08:59)

  
  不要急。我做mtt时候我的受试物本身会与mtt发生反应，使得mtt一加入就立刻显出加了dmso的颜色。而且受试物浓度越大颜色越深.我自己考虑原因为
  ：我用的那种受试物本身具有极强的还原性，会使mtt还原为兰紫色溶解在溶液里。你自己用刀豆蛋白和mtt单独做一个试验，看有无反应颜色。有的化以后加mtt时一定一定要把原来孔内的溶液全部弃去，再重新加含有mtt的无酚红培养也或者pbs，消除受试物的干扰。不要怕麻烦哦！！我后来用这种方法作就在没有出过问题了，加了mtt在镜下可以看到结晶，而肉眼观察每孔还是澄明的黄色。试试看吧，希望对你有帮助