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[求助]小鼠DC分离及培养

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-7-31 17:43    作者: 小野花    来源: 分析测试百科网

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[求助]小鼠DC分离及培养


各位师哥师姐，我培养小鼠未成熟DC，步骤如下：

1、  小鼠过量麻醉,75%酒精消毒,无菌条件下取四肢骨, 4℃ＰＢＳ冲洗2次
2、  吸取10ｍｌRPMI1640培养液放入平皿中,剪除两端软骨,直至红骨髓,冲洗骨髓腔,吹打、200目筛网两层过滤。1000Rpr 离心 5min
3、  加入红细胞裂解缓冲液2分钟,后加入10ｍｌRPMI1640培养液
4、  离心,弃上清，加RPMI1640制成单细胞悬液，吹打
5、  洗涤2次，吹打、移液
6、  细胞移至塑料培养瓶中
7、  加入1000U/ml GM-CSF, 1000U/ml IL-4（10ng/ml）
8、  加完全培养液CM 5ml
CM配方：RPMI1640
10%FBS
青链双抗
9、37℃,5%CO2，6-8天（隔天半量换液，或3天换液—同时加入IL-4、GM-CSF）

请问：
1、无菌取股骨时，有没有时间限制？
2、红细胞裂解液需要加几ml最合适？
3、一只小鼠可以培养出多少数量级的DC?
4、冲洗红骨髓时，用培养基好还是PBS好？
5、隔天换液时需不需要离心，还是直接吸取半量上清？

非常感谢！！
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最新回复

  • eric930 (2012-7-31 17:43:30)


    1.时间无限制,只要不污染,当然越快越好;
    2.看你细胞数量多少,一般4~5ml,破红后,加等量稀释终止;
    3.一只老鼠两根股骨,一般可分2块6孔板接种;
    4.影响不大,PBS便宜些;
    5.一般是3天后,轻轻悬起悬浮细胞,直接作半量换液;

  • 小野花 (2012-7-31 17:46:38)


    非常感谢。因为我是第一次养，第二天，我看见少量的贴壁细胞，我想知道，那时什么细胞。还有，我用的是培养瓶，轻轻悬起细胞，指的是将培养瓶直立，就可以吗？谢谢。

  • eric930 (2012-7-31 17:47:16)


    第二天的贴壁细胞应该属于DC的前体细胞，单核为主。

    不知你用的是玻璃培养瓶还是一次性塑料培养瓶，一般常用的都是6孔板培养，利于贴壁。
    轻轻悬起是指轻轻 前后左右 的摇晃，再轻柔的吹打几次就可以了

  • 小野花 (2012-7-31 17:55:02)


    谢谢， 我用的是一次性塑料培养瓶，今天是第三天，我不注意，把培养也全倒了，也不知会不会培养出细胞来，太粗心了

  • 笑弯了腰 (2012-7-31 17:55:56)


    DC的特性之一就是树突样,非常有利于细胞的贴壁,此时成熟的DC细胞应该贴附于培养瓶壁,若可以马上补足培养液,只要培养液保证无菌有效,对细胞影响是不大的

  • 小野花 (2012-7-31 17:56:31)


    非常感谢。我今天看了，没太大变化，接着观察吧。

  • 小野花 (2012-7-31 17:57:12)


    贴壁细胞数量比较少，细胞壁很清楚，里面有很多颗粒，周围有细小的毛刺，没有特别明显的突起，已经是第六天了，这会是什么原因呢？会不会和我第三天把培养液全倒掉有关，需要各位高手解答，非常感谢。

  • yapuyapu (2012-7-31 17:57:43)

    不知你的细胞因子是哪个公司的？

    我原先常用的浓度GM-CSF 20ng/ml、IL-4 2 ng/ml （R&D公司产品）
    1640培养基一般不用加双抗，我用的是Hyclone，效果很好。GIBCO干粉自己配置也还可以，但形态和背景不及Hyclone，两者都无需加抗生素。

    第3天半量换液，第7天基本成熟，形态典型。

    **************
    建议：1.更换培养基；
    2.调整细胞因子浓度。GM-CSF浓度可适当调高。

    祝好运！

  • yapuyapu (2012-7-31 17:58:13)


    另外血清最好也用好一点的。等条件摸索好了，再逐渐降低标准。

  • eric930 (2012-7-31 17:58:55)


    DC是贴壁生长吗？

  • 小野花 (2012-7-31 17:59:23)

    昨天刚刚又养一回，贴壁的细胞并不少，但消化的时候比较困难，大概需几分钟，谢谢。

  • 盼盼 (2012-7-31 17:59:48)

    师哥师姐：
    您们好！能否提供一些DC不同培养时期的图片呢？我是初学者想参考一下您们的。谢谢！

  • HP007 (2012-7-31 18:00:08)

    您好
    很高兴看到你的留言,我是吉林大学农学部(原军需大学)的一研究生,我最近也是养树突状细胞碰到很多的问题实验进行不下去了特着急,树突状细胞中有很多巨噬细胞还有很多其他细胞怎样纯化,我养树突状细胞悬浮时间比资料上写的晚的多不知是怎么回事,还有很多问题想向你请教,
    希望你能流下联系方式电话号码或信箱,不胜感激!

  • 小野花 (2012-7-31 18:00:26)


    你好,我没搞清楚你说的是什么，可以具体说一下吗，共同讨论，才有进步。我也是学生。

  • guagua (2012-7-31 18:03:30)

    前段时间没来才看到回复,很感谢你的回复.我从小鼠骨髓培养,用完全1640培养基,rmGM--CSF和IL-4都是10ng/ml,peprotech公司的，2天轻摇全换培养基,5天半量换液都补充新细胞因子,可到7-8天收集时悬液中虽有树突状细胞,但少的可怜,收集悬液细胞记数啥也没有,后序转染实验更无法进行,连续培养两次了都这样不知哪儿出的问题,盼望你的回复或留下具体联系方式详细向你请教．谢谢！

  • DDD (2012-7-31 18:03:54)

    你好，很感谢看到你的回信，你说的有道理，最后我得到DC很少可能是因为小鼠骨髓细胞就取的少。最近几天我有养了一次，这次依然是2天轻摇全换培养基,5天半量换液都补充新细胞因子,不过这次我加rmGM--CSF 20ng/ml和IL-4都是2ng/ml,peprotech公司的，效果次上次好点，但仍有很多问题希望你能指点一下，
    1、一只小鼠两根股骨和胫骨冲出骨髓细胞后你怎培养，用多少孔板培养多大密度？一只小鼠你最后能得到多少一只小鼠？
    2、第二天你是轻轻吹打后全换液吗？这次培养我加大细胞因子密度后（rmGM--CSF 20ng/ml和IL-4 2ng/ml）第二天换液时已看到很多簇状的前体DC，轻轻摇晃吹打培养板弃去悬液换液后发现簇状的前体DC也少很多，请问你第二天是怎换液的？
    3、以后隔天半量换液时换掉的悬液都仍掉了吗？因为越往后培养悬液中DC越多，半量换液肯定会损失很多DC
    4、培养到第6、7天时我要往用脂质体2000往DC中转染我构建的质粒，脂质体2000转染要求在无血清1640中进行，转完后还要再更换有血清的1640，所以整个过程需要两次离心换液，本来我的DC就少经过两次离心换液后悬液中DC几乎看不见了都是些碎片了，DC是不是很脆弱呀我用1500转10min转速不大呀，是我吹打细胞时用劲太大了吗？
    DC养不好我的实验就无法往后做，好几个月了养不好，心急如焚年底我都怕影响毕业，很希望能得到你的指点
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