[求助]内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的分离

最新回复

• fsdd817 (2012-8-07 13:05:40)

  
  是主动脉内皮的话，请到 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4750563&sty=1&tpg=1&age=0')

• fsdd817 (2012-8-07 13:06:00)

  
  最简单的是机械性的方法：
  1、把平滑肌细胞和成纤维细胞刮掉：前提是能分清内皮与杂细胞，工具可用较细的玻璃棒在酒精灯灼烧，拉细后灼烧末端，使其平滑。在倒置显微镜下，刮去杂细胞。
  2、采用克隆环，把内皮细胞圈入克隆环内后，用酶消化内皮细胞后培养。
  
  我使用过1，上海的克隆环较少，也较贵，没有用过。培养好了，别忘了到 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4750563&sty=1&tpg=1&age=0') 说说你的经验。顺利！

• daod (2012-8-07 13:06:27)

  
  这些方法都是得不到承认的，最好的办法就是磁珠分离，如果只是发发国内的文章，那么用上面的方法应该可以了。

• 9900 (2012-8-07 13:06:42)

  请问什麽是磁珠分离?谢谢!

• summerxx (2012-8-07 13:07:05)

  我是血管外科的研究生,最近也准备做EC方面的研究,我们可以交流交流,我的QQ是174412404,以下是我最近查阅的资料,希望对你有一定帮助.
  磁珠分选法　1980年Ryan 等人发现在内皮细胞传代实验中,使用酶解贴壁的内皮细胞会对细胞的生长造成影响,细胞老化加速,表面标记物和形态发生变化。他们选用多丙烯酰胺微粒,在摇床上轻震,发现5 min 内有50 %的微粒结合有一个或多个的内皮细胞,20 min 内内皮细胞爬满大多数的微粒,24 h 后观察到内皮细胞与微粒分离。加入新的微粒后,内皮细胞又迅速集于新的微粒上。通过孔径为44 μm 的滤网,可以将微粒与内皮细胞分离,这与后来的磁珠分选法有着异曲同工之处。进入20 世纪90 年代,一种新的细胞分选技术- 磁珠分选法逐渐成熟。磁珠是一种均一大小,直径约为50 nm 的微小球体,其大小仅相当于一个病毒的体积,在磁珠上可以通过免疫学技术标记上特定的抗
  体,然后将标有特定抗体的磁珠与目标细胞混合孵育,使其结合,在特定磁场的作用下,即可获取所需要的细胞。磁珠分选法是目前最为先进的细胞分离技术,可通过正选法直接提取所需要的细胞或采用负选法排除不必要的细胞而达到细胞纯化的作用。磁珠分选法可以分离出目前所有种类的细胞,且纯度极高,可达到9915 %以上。1992 年Abbot 等首先采用磁珠分选法纯化出人滑膜微血管内皮细胞 ,在使用Ⅱ型胶原酶消化后获得单细胞悬液,经过48h 培养,凭借外形差距,使用巴斯德吸液管除去非内皮细胞,在内皮细胞与非内皮细胞大约达1∶1 时,刮下细胞制成细胞悬液,与刀豆凝集素标记的多聚苯乙烯微粒共同孵育,待磁珠与内皮细胞结合后,使用磁性微粒集中器纯化内皮细胞。磁珠分选法的最大优点在于所获取的细胞纯度极高, Art s 等用磁珠分选法纯化皮下脂肪组织中的微血管内皮细胞,在磁珠上结合抗纤维细胞与巨噬细胞抗体,以除去这2 种主要的污染细胞,相对于以前单独采用的酶消化法,内皮细胞纯度至少提高40 % ; Kader 等采用UEA21 抗体标记磁珠,也纯化出了犬脂肪组织微血管内皮细胞 ;Cha等在酶消化和梯度离心后,再应用磁珠分选法,选取
  UEA21 作为标记抗体,所收获的胎儿皮肤血管内皮细胞纯度近100 % ; Gargett 等人在使用磁珠分选法成功分离出子宫肌层血管内皮细胞后又采用相同方法成功分离出了子宫纤维瘤、子宫良性平滑肌瘤血管内皮细胞 ; Krump2Konvalinkova 等人采用弹力蛋白酶E、胰蛋白酶、EDTA 混合消化液结合磁珠分选法从肺恶性肿瘤中分离出微血管内皮细胞,并经质粒转染后获得永生性内皮细胞株 。张鸿坤等收集犬外周血和骨髓及人脐血,经磁珠法分离出内皮细胞祖细胞,经内皮细胞生长因子诱导分化可培养出内皮细胞。目前磁珠分选法广泛应用于各种器官组织的微血管内皮细胞以及各种肿瘤性血管内皮细胞的纯化
  中,在分离过程中较常使用的抗体有刀豆凝集素(UEA) 、CD31和CD34等。磁珠分选法是一种高效的细胞纯化技术,可先通过密度梯度离心法或酶消化法等获取细胞粗提液,然后再进行磁珠分选 。其主要缺点是磁珠属一次性使用,实验成本较高,实验条件严格,对技术要求较高,但是由于其优异的分选细胞性能,现仍为各大实验室首选的纯化细胞方法。

• 大尾巴 (2012-8-07 13:07:26)

  内皮细胞能活跃吸收乙酰化低密度脂蛋白，将内皮细胞与荧光标记的Ac-LDL一起孵育后，用荧光激活的细胞分类仪即可分离出内皮细胞