[求助]怎样挑取C418筛选的阳性克隆

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• any333 (2012-8-11 11:19:12)

  
  在培养瓶内筛选阳性克隆很不方便。在筛选阳性克隆时，最好将细胞培养在6cm或10cm培养板内，这样操作起来非常方便。不知道你筛选的是什么细胞，ES细胞还是其他类型细胞？要知道，不同类型的细胞，挑选方法也不完全一样。根据你的情况，我觉得用小的玻璃吸管比较好。方法是：在酒精灯火焰上将吸管口端拉细，然后将尖细的末端烧结成细小的圆球状，因为你用的是培养瓶，所以要在吸管前端0.5－1cm处烧弯，这样才能挑取阳性克隆。挑取时，先从四周轻轻推开克隆边缘，然后使整个克隆脱离培养瓶底部。挑取克隆后，在酶滴里（20ul左右，根据克隆大小而定）将其消化为单细胞。关于96孔板单细胞接种有两种方法，其一是细胞比较大，在高倍解剖镜下可以看到单个细胞，这样的话，你可以将细胞做倍比稀释，然后用拉细的玻璃毛细管每孔放一个细胞即可。这种方法技术难度比较大，你可以采用第二种方法，即将消化的单细胞做连续10稀释（根据情况也可以加上其他倍比稀释），计算一下，当达到每100ul培养基含1个细胞的浓度时，在每个孔内加100ul即可，这样，在不少孔内理论上讲，都会有1个细胞。
  祝你成功！

• guagua (2012-8-11 11:19:35)

  谢谢你,我筛选的是永生化的肝细胞,QSG7701,虽然这些方法我具体实施起来还是有难度,但真的谢谢你,但至少让我心里有点儿底了.
  
  " 挑取时，先从四周轻轻推开克隆边缘，然后使整个克隆脱离培养瓶底部,挑取克隆后，在酶滴里（20ul左右，根据克隆大小而定）将其消化为单细胞"
  我想问问:克隆脱离培养瓶底部之后,是在原瓶里直接加胰酶吗?我怎么保证加入的胰酶不流到别的 克隆上去啊,瓶子里的克隆已经长得比较密了.
  
  谢谢!

• any333 (2012-8-11 11:19:56)

  
  当然不是在原来的培养瓶里消化. 你可以在小的无菌培养板上(例如35mm培养板)做若干大小适宜的消化酶滴,然后将单个克隆放进去,这样就可以将整个克隆消化为单细胞,而不会混杂其他克隆的细胞.
  以后再做类似实验的话,最好在培养板内培养细胞,如果你能买到克隆杯的话克隆细胞就更方便了.

• dotaaa (2012-8-11 11:20:12)

  这样操作得在超净台外，倒置显微镜下做吧
  细胞不会污染吗？

• any333 (2012-8-11 11:21:51)

  我们实验室是在超净台内的立体显微镜下做的。放置解剖镜的超净台可以购买，也可以请厂家设计制作。它与细胞传代等操作用的超净台不一样，气流方向是水平向外吹的。

• guagua (2012-8-11 11:22:12)

  啊！那我可以把倒置显微镜放入超镜台，然后紫外线消毒吗？

• any333 (2012-8-11 11:22:39)

  
  一般的超净台放入显微镜很不方便，要特殊设计的专用超净台才行。我们实验室的这个超净台是专门用来进行胚胎操作（比如冲胚、捡胚、收集胚胎）、细胞克隆挑取和离散等等。可以放置倒置显微镜，也可以放入解剖显微镜，后者操作起来更方便一些。当然可以进行紫外线消毒了，最好不要经常用紫外线消毒镜头，消毒的时候最好把镜头用锡箔纸遮盖起来，以免紫外线对镜头造成影响。

• zranqi_1 (2012-8-11 11:22:56)

  
  在细胞培养间，可以直接在倒置显微镜下进行克隆得挑取，一般只需用酒精对操作台及显微镜擦拭一下，操作得时候带帽子和口罩，当然也可以放在超净台里，我们已经在超净台外面做了很多次克隆挑取（但都在培养板或培养皿里，培养瓶操作起来很困难，因为受到瓶口的限制），至今还没有出现污染，只要严格无菌操作，污染并不像我们想象的那样容易发生

• zranqi_1 (2012-8-11 11:23:28)

  
  挑取单克隆有很多方法，挑一种比较适合自己的就可以，比如
  1.可以用克隆环
  2.象any333老师说的那样用自制的玻璃管对克隆进行机械分离，但这种方法 需要在倒置显微镜下操作，事先最好用别的细胞练习一下，可以在超净台的外面进行，。
  3.制作很多很小的盖玻片，消毒，放到培养皿里，筛选的时候有的克隆就会长到这样的小片子上，挑出来消化并作下一步处理。
  4.剪小的滤纸片，消毒，然后将这些滤纸片用胰酶湿润一下，把小滤纸片放到克隆上（掌握时间很重要），然后放到培养液里涮几下，克隆的细胞就在里面。
  5.实在没有办法，如果是玻璃的培养瓶，可以把培养瓶帅碎，^_^，下一步知道该怎么做了吧。
  说了半天，我觉得主要是你用的是培养平，口那么小，作甚么都受限制，下次改成培养皿，打开盖干什么都方便。

• summerxx (2012-8-11 14:57:52)

  不好意思，我也刚出道，回答不了您的问题，我来这儿凑个热闹，想请教：
  1、我用枪头挑的，但挑下来发现不是所有的细胞都带GFP的，为什么会不纯？是不是我在克隆上滴了少量胰酶后，克隆就移动了，带上了旁边的细胞。我觉得枪头不好，粘不住移动的克隆。或是克隆长的过大了？
  2、有人说用针灸用的细针挑，需要这么细的东东吗。
  3、我G418为600那孔内细胞大量生长，竟长满，有一部分并无GFP，但800那孔细胞全死了，咋办？
  4、以上我是用脂质体做的质粒转染，如果用于以后动物示踪实验，动物接种2月后处死做病理切片，是不是不合适，因为脂质体整合染色体少，体内无G418压力会丢失？
  5、同时，我在做病毒介导的转染，但刚刚经过流式筛选后，细胞是否增殖受影响尚不知，如果再同时做单细胞克隆，但是我的病毒转染用的质粒不带抗性，如何办。有时我细胞会出现大融合克隆，可能是铺的不均匀，这能挑吗。我挑过，细胞也不纯。可惜我们那儿只有正置的荧光显微镜。