[求助]CCK或MTT试验细胞密度和数量的问题

最新回复

• ha111 (2012-8-11 15:18:30)

  
  我目前也做MTT，也做的郁闷工
  我的贴壁细胞是24小时后加药
  也有和细胞一起接种下去的
  因为有时因为药效的问题，细胞不贴壁，所以24小时贴了以后加药较好

• zranqi_1 (2012-8-11 15:18:46)

  
  我也正在做MTT以观察药物对细胞增殖的抑制作用。我按105转96孔板，大约3天，细胞长至70－80％时同步，使大多数细胞进入静止期，24小时内加药，结果还可以。

• mamamiya (2012-8-11 15:19:05)

  
  看了您的描述,提出以下个人建议:
  1.首先您应当认识到一个问题,类似cck或者MTT之类的细胞活性测定试验,要求最好是细胞处于对数生长期进行试验,这样细胞活性比较好,才能得出比较可靠的试验结果.
  2.根据第一条原理,所以一般在将细胞转入96孔板的时候加入10^5细胞,并让细胞生长(生长天数根据您的细胞生长速度来定),一方面让细胞充分适应新的环境,另一方面让它生长到对数生长期并且正好达到足够的细胞数量.所以我们实验室一般是这样做的:转入10^5细胞后,覆盖面积大约为10%~20%,根据情况,生长2~3天后(您最好知道自己培养细胞的生长曲线,这样比较好确定生长时间),大概覆盖面积可以达到80%左右,然后就可以加药进行处理了.
  谢谢,祝您成功!

• caihong (2012-8-11 15:19:41)

  
  我刚刚做过ＭＴＴ
  我个人认为应该保证加药后细胞不要长满的前提下细胞数量要尽可能的多．
  我是加药后培养48个小时后看见细胞不是很满，就60个小时（80％融合）加ＭＴＴ继续培养4个小时.结果还比较满意．
  希望对你有所帮助．

• baidukk (2012-8-11 15:20:06)

  
  我们正在准备做ＭＴＴ，请问ＭＴＴ一定要是进口原装的吗？可以给我联系方式吗？还有我们做的是神经细胞，他不增殖的，怎么办呢？

• rxcc33 (2012-8-11 15:20:52)

  我的建议是：
  　　首先，应该做出MTT比色法中吸光度与细胞数目的关系：
  　　将生长良好的细胞经0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，计数后分别以0.1×104cell/ml ， 0.5×104cell/ml，1×104cell/ml，2×104cell/ml ， 4×104cell/ml和1.0×105cell/ml浓度铺入96孔细胞培养板，每个浓度6个复孔，培养12h贴壁后，加入MTT，以570 nm为测定波长，用酶标仪测定每孔的吸光度值。以6孔的吸光度平均值(Y)与细胞数目(X)作线性回归，得回归方程：y=ax+b(n=6)，找出细胞密度与吸光度值二者的线性关系。
  　　其次，绘制细胞的生长曲线：
  　　取生长良好的培养细胞，消化制成细胞悬液，计数后以1.5×104/ml接种于24孔培养板，每3孔为一实验组，每24h检测1组细胞数目，取平均值绘制曲线并求出细胞倍增时间。从生长曲线上可以看出，细胞经过几天可滞留期后，生长倍增时间为几d，第几达生长高峰，几天后生长变得缓慢进入平台期。体外培养的细胞宜在指数生长期进行药物筛选实验，此时细胞增殖最为迅速，平台期的细胞逐渐衰老，不宜用来进行实验。
  　　最重要的是，如果你要筛药，又不做生长曲线及吸光度与细胞数量的关系，可以用我室经过大量实验模索出的方法：
  　　96孔板接种细胞的密度为：1.5×104cell/ml，接种体积为0.2ml，即3000cell/孔，生长24小时换液，用不含血清的新鲜MEM，加药后培养48小时，在实验结束前4小时，每孔加0.02ml的MTT（浓度为5mg/ml），作用4小时，再吸出培养液，加入0.2ml的DMSO，等反应物完全溶解，也就十分钟左右，就可以用酶标仪检测吸光度值。
  　　当然，因细胞的种类不同，在接种时，细胞浓度还得再进行探索，最好将吸光度控制在0.3-0.6内。

• lgm (2012-8-11 15:21:09)

  
  请问"作用4小时，再吸出培养液，加入0.2ml就可以检测吸光度值"
  加入0.2ML的什么?加完后直接测吗?我用的细胞密度是10的6次方0.1ML每孔.就是10的5次方每孔,觉得里面一团一团的,密度大点就更严重,但是10000每孔长的一点都不好啊

• kulee (2012-8-11 15:21:31)

  请问"作用4小时，再吸出培养液，加入0.2ml就可以检测吸光度值"
  加入0.2ML的什么?加完后直接测吗?我用的细胞密度是10的6次方0.1ML每孔.就是10的5次方每孔,觉得里面一团一团的,密度大点就更严重,但是10000每孔长的一点都不好啊
  
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  最后加入0.2ml的是DMSO,加完后要让紫色颗粒完全溶解后才能测定.可以放在摇床上摇5-10分钟,然后肉眼观察一下,看紫色是否均匀,如果不均匀,也可以用手小心震荡96孔板,总之要保证完全溶解.
  我做的MTT,测定前每孔约稍少于10的5次方,OD值在0.5-0.6左右.

• owanaka (2012-8-11 15:22:12)

  看了您的描述,提出以下个人建议:
  1.首先您应当认识到一个问题,类似cck或者MTT之类的细胞活性测定试验,要求最好是细胞处于对数生长期进行试验,这样细胞活性比较好,才能得出比较可靠的试验结果.
  2.根据第一条原理,所以一般在将细胞转入96孔板的时候加入10^5细胞,并让细胞生长(生长天数根据您的细胞生长速度来定),一方面让细胞充分适应新的环境,另一方面让它生长到对数生长期并且正好达到足够的细胞数量.所以我们实验室一般是这样做的:转入10^5细胞后,覆盖面积大约为10%~20%,根据情况,生长2~3天后(您最好知道自己培养细胞的生长曲线,这样比较好确定生长时间),大概覆盖面积可以达到80%左右,然后就可以加药进行处理了.
  谢谢,祝您成功!
  
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  你说的让细胞长到80%了再加药，我认为不可，如果做生长曲线的话 应该是做几个时间点，应该保证最后一个时间点细胞刚好长到80%， 所以应该在细胞贴壁24h加药

• 911 (2012-8-11 15:22:34)

  
  看了各位前辈的帖子,受益非浅!还想请教各位,我做的是悬浮细胞(K562),应该不用先行培养吧?我是同时加药的.96孔板每孔加10~4细胞.这样做行吗?