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[求助]-80冻存复苏步骤,请帮忙看是否可行
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细胞冻存：
1. 细胞传代，计数
2. 125 g * 10 min离心，4℃
3. 弃上清，加入冻存液（10%DMSO，90%血清），使细胞浓度在1*106~1*107/ml之间
4. 分装至冷冻管中（2 ml容量），每管1~1.8 ml，封口
5. 迅速将冷冻管放入-80℃冰箱（用不用隔热的泡沫塑料盒？），分别于2天、4天、7天后复苏检验效果
细胞复苏：
1. 将冷冻管取出后迅速置40℃水浴，尽量使其在1min内融解
2. 超净台内将液体转移至7ml离心管中，加入5倍左右MEM，125 g * 10 min离心，4℃
3. 弃上清，加入5倍含20%血清的培养基，轻轻吹打均匀后转移至培养瓶中培养
不用液氮是受时间、条件所限，园中曾有人这么做过，所以也想试试。请大家帮忙看看以上步骤是否可行，不妥之处请指出，谢谢。
另外有几个问题：
DMSO用的不是进口的，对结果很有影响吗？
想让培养箱中的细胞在无人照看（不传代不换液）的情形下安然度过2周或更久，请问有无可能？培养基血清浓度、培养箱温度等条件如何设置？谢谢。
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最新回复
greenbee (2012-8-11 17:28:34)
细胞浓度不是很重要，封口必须严密。
迅速将冷冻管放入-80℃冰箱（需用隔热的泡沫塑料盒，使细胞达到缓慢降温）。
加入MEM混匀后4℃离心。
另外有几个问题：
DMSO用的不是进口的，对结果很有影响吗？
可能会有影响，但不会很大。
想让培养箱中的细胞在无人照看（不传代不换液）的情形下安然度过2周或更久，请问有无可能？培养基血清浓度、培养箱温度等条件如何设置？
无人照看度过2周是不可能的！
jrwyyplt (2012-8-11 17:30:56)
细胞冻存：
1. 细胞传代，计数
2. 125 g * 10 min离心，4℃
3. 弃上清，加入冻存液（10%DMSO，90%血清），使细胞浓度在1*106~1*107/ml之间
4. 分装至冷冻管中（2 ml容量），每管1~1.8 ml，封口
5. 迅速将冷冻管放入-80℃冰箱（用不用隔热的泡沫塑料盒？），分别于2天、4天、7天后复苏检验效果
我们是放在异丙醇盒里再放负80度，为了缓慢降温
hot_hot_hot (2012-8-11 17:31:59)
谢谢帮助，异丙醇盒？没见过，跟泡沫塑料类似的东西？
园丁## (2012-8-11 17:32:56)
假如你的细胞是很容易生长的，想想2周会长成什么样？低温培养是22-24度，可以降低细胞生长的速率，但影响没有这么大，本来是2-3天换液，2周是它的多少倍？
假如你的细胞是不容易生长的，那是肯定经不起这么折腾的。
dotaaa (2012-8-11 17:33:26)
冻存在复苏是理想的解决方法。
也可以试试你自己的想法，为什么不呢？哪怕是不可行，自己经历一下，看一下，再回想一下，再总结一下，呵呵
冻存一部分，同时留一两瓶看看结果～～
sunnyB (2012-8-11 17:33:50)
我冻存时是将冻存管先放4度半小时，再放－20度半小时左右，只要冻结就行，然后放－80度，效果不错哦。
S6044 (2012-8-11 17:34:08)
我冻存时是将冻存管先放4度30-60分钟，再放－20度2小时，然后放－80度过夜，然后-140度长期存放,效果不错哦。 讲究的是慢冻快溶原则
qumm1985 (2012-8-11 17:34:28)
将冻存管先放4度30-60分钟，再放－20度2小时，然后放－70度存放,三个月内是没有问题的。
hot_hot_hot (2012-8-11 17:34:46)
怎么我的冻存液是无血清培液：血清：DMSO=7:2:1
园丁## (2012-8-11 17:35:17)
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就是在含20％血清的培养液中加10％的DMSO，也是最简单的冻存液的配方。
caihong (2012-8-11 17:35:40)
DMSO国产分析纯音该问题不大
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