[求助]MTT结果分析

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• dragonkilly (2012-8-13 11:15:58)

  
  药物与MTT反应显色？应该不会，只有活细胞才能吸收MTT，把他还原成甲zhan（月赞），通过DMSO等有机物再溶解吸收的甲zhan（月赞），从而在490－570nm测量吸光度。
  不明白你为什么要－－“倒去药物再用无血清的培养液洗两边”，应该所有的书上都没有这一步吧？在你培养液洗两遍的过程中肯定会冲洗去一部分活着的但贴壁不牢的细胞，从而影响结果。这样很可能就会没有差别！－－本人有过相同经历。
  吸光度反而越高（显色越深）－－这点是对的，但是光平肉眼看显微镜就知道细胞相对多少，不是很准确。
  在实验室做试验会发现，经过转染质粒或siRNA的细胞，在显微镜下观察，有时候就会出现对照组比作用组死亡或调亡多的感觉，但是做流式或者RT－PCR就会发现，有时候眼睛是会欺骗你的！：）
  建议你同事尽可能减少误差和非干扰因素。
  建议你省略“倒去药物再用无血清的培养液洗两边”，直接弃去培养液。另外，加了DMSO后应该用振荡器轻轻振荡5－10min。

• ffooll (2012-8-13 11:16:47)

  药物与MTT反应显色？应该不会，只有活细胞才能吸收MTT，把他还原成甲zhan（月赞），通过DMSO等有机物再溶解吸收的甲zhan（月赞），从而在490－570nm测量吸光度。
  不明白你为什么要－－“倒去药物再用无血清的培养液洗两边”，应该所有的书上都没有这一步吧？在你培养液洗两遍的过程中肯定会冲洗去一部分活着的但贴壁不牢的细胞，从而影响结果。这样很可能就会没有差别！－－本人有过相同经历。
  吸光度反而越高（显色越深）－－这点是对的，但是光平肉眼看显微镜就知道细胞相对多少，不是很准确。
  在实验室做试验会发现，经过转染质粒或siRNA的细胞，在显微镜下观察，有时候就会出现对照组比作用组死亡或调亡多的感觉，但是做流式或者RT－PCR就会发现，有时候眼睛是会欺骗你的！：）
  建议你同事尽可能减少误差和非干扰因素。
  建议你省略“倒去药物再用无血清的培养液洗两边”，直接弃去培养液。另外，加了DMSO后应该用振荡器轻轻振荡5－10min。
  
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  加MTT前用清培养基洗我倒是确实在文献中见过，目的就是取出药物本身给结果造成的干扰，但是正如上面战友说得，可能是洗的太多，造成认为的误差。建议楼主在洗之前和之后观察一下细胞，看看是不是变化很大，因为我们这里说的也只是经验，要得到最终结果还需要自己去用实验证明，希望楼主早日找到答案。

• 阿k (2012-8-13 11:17:10)

  多谢楼上两位指点。我决定等下一批细胞长好后再试试，有结果再讨论。

• KGZ564 (2012-8-13 11:17:28)

  
  最后加DMSO前把孔中液体全部弃掉.
  这句话用了我2周时间.
  以后经常切磋切磋.

• 阿k (2012-8-13 11:17:55)

  我今天把药物加到９６孔板后，又加了２０ulＭＴＴ，结果有两个药物有结晶，一个药物变成紫色．很痛苦，实验做不下去了。请各位前辈不吝赐教。

• jkobn (2012-8-13 11:18:32)

  
  1,MTT要新鲜,(2周内)
  2.时间控制尽量严格一点,如:加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min,时间过长结果就有误差.(有个熟人看过一篇文章,我没找到)
  3.加DMSO前把孔中液体尽量弃干净.
  我遇到和你一样的情况,-------有的组药物浓度越高，显微镜下观察细胞量越少，但吸光度反而越高（显色越深）
  甚至曾空白吸光度最高.现在做较理想了.

• 阿k (2012-8-13 11:18:55)

  请问楼上你是按照你讲的就把问题解决了吗,除此之外有没有别的原因?多谢！

• 阿k (2012-8-13 11:19:45)

  
  我的MTT配制的有一个多月了，只用了一点点，如果要两周内的，就是要把以前的都扔掉了，有点浪费。

• hot_hot_hot (2012-8-13 11:20:11)

  
  我也做了MTT,其结果也和上面的战友是一样的， 药物浓度高的组在显微镜下可以看到细胞明显形状改变,可是加了DMSO之后颜色反而比没加有药物的深,不的其解,望高手赐教,不胜感激!!

• 阿k (2012-8-13 11:20:31)

  不知楼上有没有测单纯药物家MTT后的吸光度，你自己分析可能是什么原因？

• jkobn (2012-8-13 11:20:51)

  是啊,
  我注意了上面我说过的3条后,问题就解决了,基本镜下情况与数值吻合.

• hot_hot_hot (2012-8-13 11:21:16)

  
  我也做过单纯加药物和mtt了，没有颜色反应啊

• 阿k (2012-8-13 11:21:33)

  
  我今天做了一次单纯药物加MTT,有的药物加MTT后变成深紫色,如果我用加细胞后的吸光度减去药物与MTT作用的吸光度是否可行。如果不行该怎么处理，请高手指点！是否需要换别的检测方法？

• kuaizige (2012-8-13 11:21:50)

  做MTT 时，在吸走MTT 这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响OD值。我就曾有过这样的教训。
  
  我现在采用枪头慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸。

• jkobn (2012-8-13 11:22:10)

  
  我今天做了一次单纯药物加MTT,有的药物加MTT后变成深紫色,如果我用加细胞后的吸光度减去药物与MTT作用的吸光度是否可行。
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  如果每孔都有相同的紫色背景的话,用酶标仪检测时可以用(药物+MTT)孔做调零孔.
  希望你实验顺利.