[求助]细胞培养问题

最新回复

• greenbee (2012-8-13 11:23:22)

  
  你是怎样传代的，是不是吹打的，还是别的．我是做融合的肿瘤细胞，每次吹打后传的代，也没有死掉啊，死掉是什么样子的是萎缩还是碎裂的．
  一般细胞会死掉的话，（排除污染的话）多半是ph的原因，你是严格按照说明书配的吗？即使测了是７.２，也不能保证在培养中也是这样的值　．所以建议你在培养过程中，有二氧化碳通入．

• tianmei001 (2012-8-13 11:23:45)

  
  可以肯定是你细胞培养液的问题？？
  我培养液的成分：
  1640 一袋 （可以配置1000ml）
  NAHCO3 2g
  青霉素及链霉素 （具体量明天发给你，我也是新手，现在家没记住）
  配置的时候要把1640及NAHCO3分别溶解然后再合在一起，否则两个都比较不容易溶解，然后再加入双抗，最后用盐酸或者NAOH调节PH值，新手一定要用PH试纸，（稍微酸一点点无所谓），然后在外面虑一次，在无菌室过滤一次（在外面过滤过程室我们自己加的，为了进无菌室过滤的时间短一点点），最后分装，放入培养瓶中培养看是否染菌。用之前加入需要量的血清，一般复苏用含20％血清的1640培养液，传代后用含10％的1640培养液。
  
  不知道我表诉清楚了没有，如有疑问或者不同意见，欢迎继续讨论：）

• eric930 (2012-8-13 11:25:01)

  
  我是吹打传代，细胞是碎裂式死亡的，培养液变得很粘稠，不透明，像是污染的样子，但是不是污染。
  我就是按照zym145286说的那样配制的，就是多加了丙酮酸钠，也做了无菌试验，表明没有污染，也是在二氧化碳培养箱中培养的，所以一直有二氧化碳通入。一开始配成完全培养基时，我把抗生素稍微加多了一点点，第一代培养就死掉了，后来我把培养基稀释了一点点，之后第一代能生长，一传代就死掉了，我重复了两次，都只能培养一代，传代就死，我觉得非常奇怪。我从别人那儿传过来的细胞，里面含有一点别人的培养基，也是1640，只是不含丙酮酸钠，这个应该没有什么影响吧？

• xevin (2012-8-13 11:25:19)

  
  如果方便的话，建议使用别人的培养液，和自己的培养液一块培养相同的细胞，作个比较，排除培养液的影响，看是否是自己操作还是其他的原因所造成的！然后再作其他相关的检测！
  GOOD LUCK!

• zhezhe (2012-8-13 11:25:43)

  我是吹打传代，细胞是碎裂式死亡的，培养液变得很粘稠，不透明，像是污染的样子，但是不是污染。
  
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  肿瘤细胞应该是比较好养的，培养液、吹打传代都不至于导致死亡。
  “培养液变得很粘稠，不透明”，确实像是污染，也是最可能导致细胞死亡；但你说不是污染，不知是根据什么来确定的？

• baidukk (2012-8-13 11:26:04)

  不要加丙酮酸钠，因为这株细胞以前是在没有丙酮酸钠的培养基里培养的，你随意改变它的成分它会不适应的，虽然肿瘤细胞株好养，但是培养基的成分是不能随意改变的。我以前养过C6的细胞，用的是没有丙酮酸钠的DMEM，非常好养，后来没有丙酮酸钠的DMEM比有丙酮酸钠的DMEM要贵，我就试了一下有丙酮酸钠的DMEM去培养，细胞全浮起来，不贴壁，所以丙酮酸钠不要随意加进去

• mysmdbl (2012-8-13 11:26:34)

  
  我每次操作时，总是同时操作两瓶，一瓶用我自己的培养液，一瓶用别人的培养液，别人那瓶总没污染（我养细胞以来也从没污染过），而且我把自己这瓶死了之后镜检了，没有细菌、真菌类的东西，看到象是细胞破碎后，里面的东西留出来的那种感觉，没有其它的东西，而且我在培养箱里放了好多天，一直是那个样子，没见菌类繁殖，也没有污染过培养箱里其它人的细胞，所以我肯定不是污染。
  我想可能也是丙酮酸钠在作怪吧，不然的话，不知是不是HEPES加的量不对，我每升里加HEPES 5.9克，不知你们是加多少？不过HEPES主要是起一个缓冲的作用，应该没很大影响吧？

• yes4 (2012-8-13 11:26:49)

  
  那个培养液中的双抗浓度为100u/ml.
  我今天又发现一个问题，你说开始的时候可以养好，传代后出现的问题，那会不会是你传代过程中出现了某些问题呢！！
  我想到的能存在的问题是：
  1）消化液有没有问题。
  胰酶 0.25g，Nacl 4.0g，kcl 0.2g，Glucose 0.5g，NaHCO3 0.29g，EDTA 0.1g,将上诉依次溶入495ml三蒸水中，加0.5ml青霉素（10万单位1ml）0.5ml，链霉素（10万单位1ml）0.5ml，调节PH值7.4，加水至500ml，滤菌，分装，4度下保存。（保证其中无Ca和Mg离子）
  2） 消化的时间是不是太长了，使得消化过了，然后致死细胞。一般细胞消化的时间都是2－3分钟，而且要随时观察状态啊。
  3） 吹打细胞的时间是不是也长，力度是不是合适啊。吹打细胞可以吹打几下，看看干净了没有。还有我们消化后培养瓶中的细胞是经过拍打才下来的，不是吹打下来的，你可以试一下，挺好用的。
  
  我发现的就这些，不知道其他人有那些高见，望指教。

• langlang (2012-8-13 11:27:32)

  
  我猜你培养的是悬浮细胞，这类细胞传代吹打不宜过狠，只要轻吹使细胞分散开来，另外一定需要离心，因为培养中有一些老化，凋亡的细胞会形成你所说的细胞碎片，一般800rpm,5-7min, 或更低转速，目的是使碎片悬在上清中，而完整细胞沉下来。去上清后重悬培养即可。不经此步骤，死细胞成分会越来越多，当然养不好了。
  我所知道的有的转速低至600，具体要视你的细胞而定。祝好运！

• qqq111 (2012-8-13 11:28:14)

  
  zym145286
  胰酶 0.25g，Nacl 4.0g，kcl 0.2g，Glucose 0.5g，NaHCO3 0.29g，EDTA 0.1g,将上诉依次溶入495ml三蒸水中，加0.5ml青霉素（10万单位1ml）0.5ml，链霉素（10万单位1ml）0.5ml，调节PH值7.4，加水至500ml，滤菌，分装，4度下保存。（保证其中无Ca和Mg离子）
  
  胰酶的浓度只有0.05％，不对吧