[求助]细胞消化后成团

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• kulee (2012-8-13 14:58:35)

  很多贴壁细胞贴壁能力很强，一般光用姨酶消化的话很难完全打开，经常出现成团的现象。但很多实验象免疫荧光还有流式都要求细胞要分开成单个细胞。
  这样的情况其实很简单的，只要消化的时候加点EDTA就可以了！细胞就会成均匀的单个。配姨酶的时候加一点，浓度0.02就可以了！楼主可以试试看！

• summerxx (2012-8-13 14:58:54)

  是什么细胞,另外消化后成团也没什么的呀,只要你离心后把沉淀弹开,用培养液重悬,在把细胞悬液加入培养瓶中,这时候用吸管小心吹打几次,就可以混匀了

• dotaaa (2012-8-13 15:36:39)

  我细胞在传代消化后很容易成团，而且吹打也没有什么特别作用，这是什么原因呢？该如何去防止呢？
  
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  加EDTA很有用，我们一般就是这样处理的。不过加入胰酶后的终浓度是1%（体积比）

• dotaaa (2012-8-13 15:41:35)

  
  加EDTA很有用的，我们处理细胞时也是这样做的。不过终浓度是1%（体积比）

• is2011 (2012-8-13 15:41:57)

  
  我消化后不离心的 把胰酶倒掉 直接加培养基的 这样会不会有影响呢？

• redbutterfly (2012-8-13 15:42:16)

  
  二价的离子如钙镁离子如果存在于消化液中，则有富集细胞的作用，用EDTA配制而成的混和消化液的作用机理就是EDTA可以鳌合二价的离子，减少细胞的集聚。
  请注意你的消化液一定要用无钙镁的BBS溶液配制如D-HANKS液等

• fei1226com (2012-8-13 15:42:35)

  
  我看到书上说EDTA不能被血清中和，消化后就要用PBS液彻底清洗，否则细胞容易脱壁。
  我们实验室从来都不用PBS洗，照样细胞传得很好，但是我这么做的效果就不怎么好了，我怕用PBS洗会把细胞洗掉啊，你们一般加了EDTA消了后清洗不呢？

• jujuba (2012-8-13 15:43:19)

  
  我消化后不离心的 把胰酶倒掉 直接加培养基的 这样会不会有影响呢？
  
  会有影响的
  你用胰酶消化后是细胞悬液
  经过离心可以是细胞沉积,在用培养液重悬,这样细胞的密度才会大些
  胰酶里是要加EDTA的,EDTA可以和细胞间连接组织中的钙结合,是一种非酶消化液
  我一般用一点培养液冲洗一下,这样减少它的影响

• zhenxin (2012-8-13 15:47:59)

  我们使用的胰酶是不含EDTA的，当消化后直接将消化液倒掉，也不用PBS进行冲洗，然后直接加含血清的培养基吹打，然后就接种到不同的瓶子里。以前细胞都没有成团现象的，但是现在总是成团。在终止消化后，没有及时吹打，放置时间超过一分钟会有影响吗？

• Ao7 (2012-8-13 15:48:16)

  
  消化液里加入edta可以减少细胞成团的现象，血清可以终止胰酶的作用，如果是进口血清的话也能终止edta的作用。用胰酶消化后胰酶可以倒掉，也可以不倒，直接加血清终止，如果消化液中加入了edta的话，就要将消化液倒干净，如果细胞贴壁要求不是很严格的话，一般不需要进行离心。

• tangxin_80 (2012-8-13 15:48:35)

  
  我也是刚做细胞培养不久，用的胰酶是0。05％胰酶＋0。02％EDTA，开始是消化细胞总是成团（计数严重不准）。现在消化基本都是单细胞悬液了，总结了一下经验：1，细胞千万不能长太满，80－90％就好（细胞刚刚基本成单层细胞，没有出现成层生长）2 用pbs洗两遍，加入消化液，镜下看出现细胞回缩，倒掉消化液（放置一会儿，用残留的胰酶消化）待细胞边圆，吹打就好了，基本不用使劲吹就都下来了。3消化过程中最好不要使劲摇动培养瓶，这样细胞特别容易成屑样脱落。

• fqswdzd (2012-8-13 15:48:51)

  
  我们传代时都是直接把胰酶和EDTA加入细胞中，消化好后直接加培养基吹散再分瓶，这样可以吗？我觉得效果还挺好的

• jrwyyplt (2012-8-13 15:49:13)

  我看到书上说EDTA不能被血清中和，消化后就要用PBS液彻底清洗，否则细胞容易脱壁。
  我们实验室从来都不用PBS洗，照样细胞传得很好，但是我这么做的效果就不怎么好了，我怕用PBS洗会把细胞洗掉啊，你们一般加了EDTA消了后清洗不呢？
  
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  PBS对于细胞来说环境过于艰苦,一般我们都不采用PBS洗细胞,如果因为别的原因要求洗掉EDTA,可以用营养液直接洗.只是单纯的传代或冻存是不需要洗的.而且我自己做细胞培养的时候会在消化后留一点EDTA,用拍打瓶壁的办法使细胞脱壁,然后加入培养基,不用吹打,这样比较节省吸管..可以一根吸管传多瓶细胞.

• jrwyyplt (2012-8-13 15:50:36)

  
  有些细胞就是成团生长才能长好,比如内皮细胞.看看你的细胞是否属于这种.如果消化完全成单个,生长不见得好.

• xingyi08 (2012-8-13 15:50:54)

  我觉得你可能是消化过头了。一般用1mMEDTA消化1分钟后，吸去EDTA，然后0。025％－0。5％的胰酶消化1－3分钟就足够了。再长一点时间，细胞就会消化过头，反而成团了。
  如果你在传代前先换用新鲜的培养基37度孵育细胞两小时，细胞容易消化成单个的。

• dotaaa (2012-8-13 15:51:29)

  
  传代前先换用新鲜的培养基37度孵育细胞两小时，细胞容易消化成单个的。
  请教一下这个是什么道理啊，我的细胞也是消化后容易聚集，而且要培养一段时间后才能分开，在镜下就是一个个的黑团，很碍眼。