[求助]麻烦看看我冻存细胞的步骤有什么不对的？

最新回复

• wood533 (2012-8-16 12:14:20)

  我的建议是消化后进行细胞技术，冻存细胞的浓度对细胞复苏的成功率有影响。一般来说调整细胞浓度在5×106/ml左右。至于冷冻过程控制好时间就行。

• okhaha (2012-8-16 12:14:41)

  
  我们冻存细胞是要加冷冻保护剂(DMSO)的,即MSO:血清:培养基=1:3:5 用无血清培养基打散细胞后转入备用小瓶,加入相应比例的血清和DMSO后,转入冻存管.我们不经过4℃— -20℃的过程,直接放置于-80℃快速冷冻(过夜),然后丢进液氮里

• milkdog (2012-8-16 12:15:08)

  
  对于某些娇气的细胞来说，酶液吸净后，最好加入胰酶终止剂或者带血清的培养基，冻存液中血清的浓度也是关键的，一般来说， 浓度高一些好。

• join (2012-8-16 12:15:31)

  消化后吸尽酶液?
  我导师坚决反对这种做法,直接加培养液终止即可.

• fqswdzd (2012-8-16 12:16:00)

  比较标准的步骤应该是这样的：
  1加入胰酶消化
  2　终止消化后加入适量培养，调节细胞浓度不低于106/ml。
  3　预先配好冷冻液：20%的牛血清、20%DMSO，亦可以加入适量的生长因子。
  4　将冷冻液与细胞悬液按1：1混匀
  5　然后入4度冰箱40分钟，再转置－20度2个小时。放入液氮口过夜，再置入液氮中
  如此操作，细胞存活比很高，不妨一试啊。

• 园丁## (2012-8-16 12:16:25)

  谢谢。
  1.取出生长至对数期的细胞，用pbs清洗
  2.倒尽pbs液后用胰酶消化，消化后吸尽酶液
  3.加入适量无血清1640培养液，打散细胞后将液体转入冻存管中后离心
  4.吸尽1640培养液，加入适量冻存液，打散后一次4°C－-20°C－-80°C－液氮
  以上步骤有哪些不对的地方还望高手们多指教。
  
  ————————————————————————————————————————————————
  
  影响细胞存活的关键在合适的冻存液和冻存速度，而你的方案恰恰没有提及这两点，因此，很难“指教”。

• newway (2012-8-16 12:17:30)

  
  1.取出生长至对数期的细胞，用pbs清洗
  2.倒尽pbs液后用胰酶消化，消化后吸尽酶液
  3.加入适量无血清1640培养液，打散细胞后将液体转入冻存管中后离心
  4.用冻存液重悬 ，再次离心。
  5.冻存液重悬，4°C，30min－-20°C,30min－-80°C,过夜－液氮长期保存
  冻存液：10%DMSO+ 90%胎牛血清（效果较好）或者70%培养基+10%DMSO+20%胎牛血清

• 气泡 (2012-8-16 12:17:49)

  可以从一下三个方面进行改进：
  
  1.冻存液其实就用普通你培养时的培养基，加10%－20%的血清，或者就用血清作冻存液。
  2.加入7%－10%DMSO（细胞培养级的）做保护剂。
  3.用程序降温仪冻，程序为：室温至-20°C降温速度为1°C/min，-20°C至-100°C降温速度为5°C/min。（室温降至-20°C期间最为关键，降温速度一定要慢，冻得效果主要取决于这个阶段）
  
  如果能做到以上三点冻存细胞绝对不会有问题。如果没有程序降温仪，可以先放冰箱4°C保持1小时，再放-20°C保持1小时，再放-80°C过夜，然后放入液氮。也可以加一步放液氮气相。这样效果没有程序降温仪好，但一般的细胞也没有太大的问题。

• yes4 (2012-8-16 12:18:48)

  几点意见，
  1，细胞消化后吸净酶液这一部可能会让你损失不少细胞，建议不要使用。因为在加入细胞保存液之前的离心后，可以将全部的上清也吸出。
  2，细胞计数是不可少的，最佳的细胞保存浓度在5＊105－106／ml。
  3，细胞保存液很重要，我在这边的试验室是直接购买的Cell bank。
  4，我一般是－20度24小时，－80度24小时，然后放入液氮中不是很讲究。
  5，如果不放心，可以在试验前将细胞复苏，计算细胞存活率。

• yychen (2012-8-16 12:19:27)

  介绍几个常见的简历格式
  
  1个人概况:
  
  求职意向;  ________________      
  姓名:  ________________  性别:  ________
  出生年月:  ____年 __月__日  所在地区：  ___________
  学历：  _______________  专业:  __________________
  婚姻状况：  _______________  目前年薪：  __________________
  
  联系方式:
  
  住宅电话：      公司电话：  _____________
  BP：   _____________   手机：  _____________
  个人主页：         
  通讯地址：____________________________________________________
  邮政编码：____________________________________________________
  
  教育背景:
  
  最高学历：  __________________________   最高学历学校：_____________
  专业：   _____________   时间：____年___月 至 ____年___月
  第二学历：  _____________   第二学历学校： _____________
  专业：   _____________   时间：____年___月 至 ____年___月
  教育情况描述：（此处可注明：所修课程、在学校所参加的组织活动、担任职务、获奖情况、发表的文章等，请依据个人情况酌情增减）
  ______________________________________________________________________________
  _________________________________________________________________________________
  
  外语能力:
  
  外语一：  基本技能：_____________________   通过标准测试：__________________
  外语二：   基本技能：______________________  通过标准测试：___________________
  其它：
  
  工作经历:
  
  ____年____月——____年____月_______________公司_______________部门_______________工作
  ____年____月——____年____月_______________公司_______________部门_______________工作
  （此处应为整篇简历的核心内容,应聘者可以着重叙述此项,并根据个人工作情况不同而重点突出说明工作具体内容与经历，尤其是与求职目标相关的工作经历；一定要说出最主要、最有说服力的工作经历和最具证明性的为公司获取的利润和相关成绩； 说明的语气要坚定、积极、有力； 具体的工作、能力等证明材料等； 写工作经验时，一般是先写近期的，然后按照年代的顺序依次写出。最近的工作经验是很重要的。在每一项工作经历中先写工作日期，接着是工作单位和职务。 在这个部分需要注意的一点是，陈述了个人的资格和能力经历之后，不要太提及个人的需求、理想等。）
  
  个人能力:
  （如电脑能力、组织协调能力或其他）
  ________________________________________________________________________________
  
  个人爱好:
  （突出自己的个性，工作态度或他人对自己的评价等）
  _______________________________________________________________________________
  
  其他说明:
  
  （如获奖情况等）
  __________________________________________________________________________ _
  
  2个人概况:
  
  求职意向;  ________________   
  姓名:  ________________  性别:  ________
  出生年月:  ____年 __月__日  健康状况:  ___________
  毕业院校:  _______________  专业:  ____________________
  电子邮件:  _______________  传呼:  ____________________
  联系电话:  _______________   
  通信地址:  _______________  邮编:  ____________________
  教育背景:
  
  ____年-- ____年 ___________ 大学 __________专业(请依个人情况酌情增减)
  主修课程:
  
  ________________________________________________(注:如需要详细成绩单,请联系我)
  论文情况:
  
  ____________________________________________________(注:请注明是否已发表)
  英语水平:
  
  * 基本技能:听、说、读、写能力
  * 标准测试:国家四、六级;TOEFL;GRE.....
  计算机水平:
  
  编程、操作应用系统、网络、数据库......(请依个人情况酌情增减)
  获奖情况:
  
  ________________ 、________________、________________ (请依个人情况酌情增减)
  实践与实习:
  
  ____年__月-- ____年__月 _________公司__________工作
  ____年__月-- ____年__月 _________公司__________工作(请依个人情况酌情增减)
  工作经历:
  
  ____年__月-- ____年__月 _________公司__________工作(请依个人情况酌情增减)
  个性特点:
  
  ___________________________________（请描述出自己的个性、工作态度、自我评价等）
  另：

• yychen (2012-8-16 12:19:50)

  另：
  (如果你还有什么要写上去的，请填写在这里！)
  * 附言请写出你的希望或总结此简历的一句精炼的话!)
  例如:相信您的信任与我的实力将为我们带来共同的成功! 或希望我能为贵公司贡献自己的力量!
  
  3RESUME
  
  Education
  • 1986.9-1992.7: the XITILU Primary School, Shaoguan, Guangdong
  • 1992.9-1998.7: the No.1 Middle School, Shaoguan, Guangdong
  • 1998.9-2002.7: Management School , Zhongshan University
  Specialized courses
  Systematically mastered accounting and auditing courses. Achieved scholarship per year. Took 5 subjects of the CPA examination in 2001.
  Computer Abilities
  • Minor in Computer Software. Skillful in Dos, Windows, Microsoft Office, UFERP-M, FoxPro, C, etc. Passed National Computer Rank Test Band 2. Took the National Programmer Test in 2001.
  • Experienced in Network. Assumed as Network-Administrator of student’s dormitories.
  Languages skill
  • Command of both spoken and written English. Passed CET4, 6 and BEC2.
  • Fluent Mandarin and Cantonese.
  Rewards
  • 1992-1998:Scholarship in middle school per year. Third prize of China Mathematics contest of senior middle school.
  • 1998-1999:Third prize scholarship of Zhongshan University.
  • 1999-2000:Third prize scholarship. Second prize in the thesis contest of Management School.
  • 2000-2001:Second prize scholarship. Third prize in the study contest of Party Constitution.
  Party and social experience
  • 1998.9-1999.7
  As Undersecretary of Computer section, Student Union, Management School.
  Participate in organizing the Website-Design match.
  Participate in organizing the Poem- Elocnte match.
  • 1999.9-2000.7
  As commissary in charge of publicity of Accounting department.
  As minister of Information section, Accounting Association, Zhongshan University.
  Participate in organizing the lecture of PricewaterhouseCoopers.
  Participate in organizing the cross-country sponsored by Jianlibao Corp.
  Took the training course of Communist Party of China.
  • 2000.9-2001.7
  As Vice-president of Accounting Association, Zhongshan University.
  As commissary in charge of organization of class.
  Participate in editorship of the Window of Accounting and Newsletter of Management School.
  Joined the Communist Party of China in June, 2001.
  • 2001.9 to present
  As League branch secretary in class.
  Working experience
  2000.3 to present: As assistant of Administrative section, Management School.
  2000.7 to present: As Network-Administrator of student’s dormitories in Zhongshan University.
  2001.1 to 2001.4: Internship in Kangyuan Certified Accountant Corp, Guangzhou.

• KGZ564 (2012-8-16 12:20:34)

  消化后吸尽酶液?
  我导师坚决反对这种做法,直接加培养液终止即可.
  
  ————————————————————————————————————————————————————————————
  
  能 请 问 为什么 吗？我 刚 开始 养 细胞 ，每次 都 把 胰酶 吸 掉 了 。。。。。。新手 上路 ，问题 很 菜 ，不好 意思 ......

• zranqi_1 (2012-8-16 12:20:52)

  其实最重要的是冷冻的时间,一般来说,标准的时间是,4℃30-60min,-20℃30min,-80℃过夜,然后移到液氮中长期保存,从-80℃移往液氮时保证细胞的温度不能高于-60℃.再就是冻存管中的细胞不要直接放入冰箱,应该是放在异丙醇中.

• xingyi08 (2012-8-16 12:21:56)

  
  我的冻存方法如下.细胞一年后复苏都可以.
  先将旧培养基吸弃,加入胰酶消化(酶的用量跟消化时间不同细胞具体不同,要自己摸索),再加入含血清的培养基终止,离心去上清,细胞计数,用冻存液(培养基:血清MSO为7:2:1)调成每毫升5x106个,先置4℃4h,-20℃24h,-80℃一直保存.一年后复苏都行.