[求助]为什么我分离的淋巴细胞一洗就没有了

最新回复

• leifengta (2012-8-24 13:16:17)

  
  离心要算好转速，不同的离心半径需要的转速不同。
  
  分层后淋巴细胞不会形成白色沉淀，而是在分界面上方形成一条透明带，这个带子里就是您要的细胞。

• fei1226com (2012-8-24 13:16:37)

  
  我是从分层后的那个白色云雾状的层里取的细胞出来，然后再离心，就看不出来了（加Hank's或1640稀释），那个透明带怎么看得出来呢？我这个液体几乎都是透明的
  谢谢您！！！
  第一次问问题，心情很忐忑的

• leifengta (2012-8-24 13:16:58)

  
  这时的沉淀也应该是透明的，你只要按照常规方法继续下去就行了，洗下来后在显微镜下一定可以看得到的。

• gemei0115 (2012-8-24 13:17:18)

  根据我的经验,你可以沿管壁加,很慢慢的,加出来就界面非常清楚.

• tangxin_80 (2012-8-24 13:17:36)

  先不要着急，大家帮你找找原因肯定能做好的。
  
  首先，你沿管壁慢慢加，形成界面是没有问题的。有部分红细胞下沉也很正常，这不是没有形成界面，而是由红细胞本身的密度和容易叠连的性质决定的。这个个体差异比较大，有些人的血液标本红细胞更容易下沉些，特别是患有自身免疫性疾病的人，比如SLE。即使加样时分层很清楚的多放置一会儿红细胞也会下沉，对最后的分离结果没有影响，因为红细胞本来就是要沉下去的。
  
  第二，离心速度要慢升慢降，将离心机的刹车(brake)关掉，这点至关重要。
  
  第三，取PBMC之前，将上层的多余液体先吸掉一些，留下距离云雾层1cm就行了。吸取PBMC时，枪头或吸管是在云雾层上面一点的位置吸，不要插到云雾层里面或下面去。新手可能取得不干净，吸完自己看一下那层白色的细胞是否已经吸干净了，但又不能为了取干净吸得过多，分离液多了不利于下一步的细胞沉降。以吸出最少的液体，取出最多的PBMC最好。
  
  第四，你分离的血量是多少？如果血量很少那最后的细胞团本来就很小的，不要因为看不到明显的细胞团就放弃，还是用很少的液体悬浮起来在镜下看一下有没有细胞。
  
  先说到这儿吧

• fei1226com (2012-8-24 13:17:58)

  谢谢大家的帮助，我真是很感动。
  今天我又做了一次，换了天津TBD的分离液，能够看到很清楚的白色细胞层，然后我用Hank's液将其稀释到5ml，再1500rpm10min离心，还是没有看到细胞沉淀，但是我继续取了最下面的液体再稀释离心，在镜下我看到了单个核细胞，所以后来的操作尽管都没有沉淀，但是我还是都取最下面的液体进行操作，不知道这样取到的细胞质量怎么样？
  谢谢了

• 园丁## (2012-8-24 13:18:17)

  “用Hank's液将其稀释到5ml，再1500rpm10min离心，”
  你的稀释量太少，导致溶液的比重较高，细胞不易沉淀下来。建议至少稀释到10ml（离心管装满，越多越好），再用水平离心机离心沉淀，一定能看到你需要的细胞了。

• am10 (2012-8-24 13:18:33)

  
  我不太同意楼上的观点，我最近一直在做这个实验，有时会碰到像你那样的情况，离心后看不到细胞沉淀，原因有几点，一个确实是我吸的分离液有点多，导致细胞不宜离下，另外就是体积太大，离心时间不够，有一次，我稀释到了十几毫升，10分钟后离不下来，我就把他分成两管，每管稍微加了一点PBS加到差不多8毫升，又多离了15分钟，就可以看到细胞沉淀了，但主要还是分离液吸的太多了，这一点一定要注意。

• vivian4123 (2012-8-24 13:19:00)

  
  你看不到沉淀是不是因为你提出的细胞数量太少啊，肉眼看不出来吧

• xyw5 (2012-8-24 13:19:33)

  
  依我的经验，各种资料中要求稀释血一定要沿着管壁轻轻加下去这一点并不是太重要，关键还是离心力和分离液质量！不要照搬资料上的转速（要考虑离心半径），要根据自己的离心机摸索一个最佳离心速度！