硕士的时候曾经做过这部分试验，我用的是原位灌注的方法，液体流向为从从下腔静脉进入，从门静脉流出。
灌注的时候分为两步，首先用HBSS到血液清洗干净为止，然后换为含有collagenase的L-15。然后利用Percoll分离，最后使用Hepatozyme-SFM进行培养，通常两周细胞生长很好，可以用来进行各种后续试验
此外不知道楼主培养的是大鼠还是小鼠的细胞，给你提供几篇文章，当初在确立方法的时候我本人从中受益匪浅。
1. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Chacko, J., and Trump, B. F. (1981). Mouse liver cell culture 1. hepatocyte isolation. IN VITRO Vol.17.No.10 October, 913-925.
2. Kreamer, B. L., Staecker, J. L., Sawada, N., Sattler, G. L., Hsia, M. T. S., and Pitot, H. C. (1986) Use of low-speed ,iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIO. Volume 22,Number 4,April 201-211.
3. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., (1989) Lysis of cultured mammalian cells. Molecular Cloning. 18.34
最新回复
yychen (2012-8-25 09:04:59)
呵呵,我也在做原代肝细胞培养,好长时间了,做得不理想
有北京的XDJM也正在做吗?我们一起做吧
dongdongqiang (2012-8-25 09:05:28)
你们的原材料（细胞、培养基、补充物）怎么样？
我 可以 为您提供美国原装进口的细胞和对应的培养基。产品全程跟踪服务！
tie8 (2012-8-25 09:06:04)
肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，我目前已经成功的培养了成人肝细胞和胚胎肝细胞，现分别介绍如下”
首先介绍原代肝细胞的分离。
目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下：
1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露，结扎离断脾动脉、胃左动脉，显露腹腔动脉干。轻轻抬起肝脏，显露其下的门静脉，将其从周围的淋巴组织中分离出来，注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠系膜上静脉的会合处。将灌注导管插入门静脉，并结扎牢靠，在远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。
2:灌注液的配置：
Perfusion Solution 1（g/L）：
NaCL 8.000
NaH2PO4•2H2O 0.078
KCL 0.400
Na2HPO4•12H2O 0.151
NaHCO3 0.350
EDTA 0.190
HEPES 2.380
Glucose 0.900
磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2～7.4（使用pH计）， 0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4℃保存，使用时液体温度维持在37℃（应用水浴箱）。
Perfusion Solution 2（g/L）：
NaCL 8.000
KCL 0.400
CaCL2 0.560
NaH2PO4•2H2O 0.078
Na2HPO4•12H2O 0.151
HEPES 2.380
NaHCO3 0.350
Collagenase Ⅳ 0.500
搅拌器使固体成分充分溶解，4℃冰箱过夜，以后同上。
4:灌注步骤：
4.1 37℃Perfusion Solution 1沿门静脉插管灌注肝脏，流速20－30ml /min，灌洗10min左右，至肝脏呈现灰白色为止
4.2 Hanks液80ml 短时间灌注，约2min，冲出EDTA
4.3 37℃Perfusion Solution 2 沿门静脉插管灌注肝脏，流速20mL/min，灌洗10min左右，循环使用
4.4 肝脏变软，塌陷后用无菌镊钝性分离肝细胞，去除肝包膜及血管等结缔组织，将含有胶原酶的肝细胞悬液放入250ml无菌烧杯中（杯口用无菌锡纸包裹），37℃水浴5min
4.5加入无指示剂的DMEM基培，双层无菌纱布过滤
4.6将滤液放入50ml离心管中，应用无指示剂的DMEM基培，4℃、50g、3min洗涤肝细胞3次
5:获得的细胞经过以下的纯化，应用特定的培养基培养。
－－－－－未完待续。
HP007 (2012-8-25 09:06:48)
HP007 (2012-8-25 09:08:12)
求教 :
1 为什么要用无指示剂的DMEM?
2 原位灌不行吗?
3 我刚分下来就染胎盘蓝,就已经死了很多,操作时间很短的,原位灌的,取下肝脏时,老鼠还活着呢.什么原因呀?
jkobn (2012-8-25 09:08:30)
我没有用肝组织灌流，而是直接将组织剪碎用胶原酶消化，这次效果很好。我觉得可能是红细胞裂解液对肝细胞损伤很大。应注意其与细胞悬液的比例。
ending (2012-8-25 09:08:49)
硕士的时候曾经做过这部分试验，我用的是原位灌注的方法，液体流向为从从下腔静脉进入，从门静脉流出。
灌注的时候分为两步，首先用HBSS到血液清洗干净为止，然后换为含有collagenase的L-15。然后利用Percoll分离，最后使用Hepatozyme-SFM进行培养，通常两周细胞生长很好，可以用来进行各种后续试验
此外不知道楼主培养的是大鼠还是小鼠的细胞，给你提供几篇文章，当初在确立方法的时候我本人从中受益匪浅。
1. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Chacko, J., and Trump, B. F. (1981). Mouse liver cell culture 1. hepatocyte isolation. IN VITRO Vol.17.No.10 October, 913-925.
2. Kreamer, B. L., Staecker, J. L., Sawada, N., Sattler, G. L., Hsia, M. T. S., and Pitot, H. C. (1986) Use of low-speed ,iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIO. Volume 22,Number 4,April 201-211.
3. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., (1989) Lysis of cultured mammalian cells. Molecular Cloning. 18.34
HP007 (2012-8-25 09:09:09)
能不能传张照片上来瞧瞧?到底应该什么样?我的总不贴壁.
[求助]肝细胞原代培养