[求助]帮忙看一下双染的照片

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-8-25 12:48 作者: plaa 来源: 分析测试百科网

麻烦高手帮忙看一下AO/PI双染的照片，分析一下问题
1.为什么照片拍出来中间有些部位很亮，是不是浓度太高，终浓度8mg/ml.
2.背景怎么很多荧光染色的小点，pbs洗了两遍，又重悬，pbs高压灭菌。
3.有些细胞胞质怎么也有绿色，但颜色较浅。
3.细胞是否发生凋亡。
4.细胞周围很规则的圆形突出是不是凋亡小体，如果细胞形成凋亡小体，一般是一个还是很多围绕在细胞四周。

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plaa (2012-8-25 12:48:59)

再来一张

91533222.snap.jpg
summerxx (2012-8-25 12:49:22)

背景中有荧光光点我也遇到过，主要可能有两个原因：
1.PBS未洗净，或PBS本身较脏，根据你的叙述可以排除
2.抗体的原因，抗体保存一段时间后，会出现蛋白沉积形成颗粒的现象，这种颗粒如果粘附在玻璃表面则不易洗掉，因此遇到这种情况在加一抗和二抗之前，最好将抗体短暂离心，如果抗体只剩管底那么多，吸的时候抢头不要进太深。
真是抱歉啊，楼主，看了是荧光图片，就想当然的以为是加了一抗二抗的，我所说的仅限于免疫荧光染色
plaa (2012-8-25 12:49:51)

我没有加过抗体，只是做荧光染色
hot_hot_hot (2012-8-25 12:50:16)

有光点很可能是因为染料中由于保存时期长有沉淀,建议在染色前将染料高速离心5-10分钟, 取上层澄清的用来染色.
DDD (2012-8-25 12:50:34)

照片是染的细胞还是细胞团？放大倍数是多少？
plaa (2012-8-25 12:50:54)

细胞染色，也许没有吹打开形成细胞团，其实是想做细胞的。放大400倍。
能否告诉我你的染色方法和终浓度，我怕细胞如果发生凋亡会漂浮起来，所以是把贴壁细胞消化后重悬染色的。
dongdongqiang (2012-8-25 12:51:19)

AO－PI溶液配制：用Dulbeccos液配制储存液，AO : 670umol/L，PI：750umol/L，4℃暗处保存，临用前取0.01ml AO与1ml PI混合，用Dulbeccos液10倍稀释，0.22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合10分钟，在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片，510nm光栅滤光片可同时见到绿色（AO）和红色（PI）荧光。
Dulbeccos液可用Hank‘s液替代。
eric930 (2012-8-25 12:51:38)

这种试验我同学做过,我没有具体看过,我搞过凋亡的形态学,所以可以提供一些思路和建议给你:
1 最好不要把贴壁细胞消化后重悬染色,爬片后直接染,当然爬片要匀.不要成团,大多数凋亡细胞仍然贴壁.
2 如果细胞形成凋亡小体，一般是一个还是很多围绕在细胞四周?
开始觉得凋亡很神秘,从来没见过.后来做了扫描电镜,凋亡小体可以是一个,也可以是多个.甚至可以完全脱离细胞.
3 你可以将染液过虑一下,或者按 hbcsc 战友说的离心一下.看背景会不会少一些.
4 我觉得哪些有荧光染色的杂点有可能是坏死细胞的碎片.
5 凋亡小体这样象花环样的,我没见到过,如果是的话,可能和你的细胞种类和干扰方法有关.
plaa (2012-8-25 12:51:55)

凋亡小体这样象花环样的

我不知道那是不是凋亡小体
plaa (2012-8-25 12:52:20)

不是说晚期的凋亡细胞会漂浮，而且早期和晚期的凋亡细胞贴壁不劳，染色前用pbs洗不就洗掉了吗