[求助]请教关于培养乳鼠心肌细胞的贴壁的问题!

最新回复

• jrwyyplt (2012-8-25 15:27:27)

  
  24小时后，细胞就已经能看出形态了，而且还会跳动，如果还是圆形的要么就是非心肌细胞，要么就是没贴壁。换液前培养液当然需要预温，不放在37度也得提前室温放1-2小时。

• star#room (2012-8-25 15:29:23)

  
  刚消化好的是圆形，但培养24小时后，如果还是圆形并随着培养液的晃动而移动则说明肯定没有贴壁。所以就不会看到体积变大,伪足,不规则形等。在心肌细胞培养中一个非常重要的问题是接种的数量一定要足够，可以采用参考文献中的上限。当密度不够时，单个细胞很难生长，也就很难成功。

• qqq111 (2012-8-25 15:29:48)

  请问 ,那么会不随着培养液的晃动而移动的就是贴壁了吗?我的接种密度是3乘10的5次方/ml,够吗?我用6孔板,每孔2ml.

• summerxx (2012-8-25 15:30:04)

  你不可能每次观察时都去晃动培养液吧，况且随着培养液的晃动，已经贴壁的细胞难免会受到扰乱。应该说，不随着培养液的晃动而移动的细胞是贴壁的。原代心肌细胞培养的历史很长，不同接种密度的文献报道都有，常见的是从10的5次方到10的6次方/ml之间。接种的细胞密度低（<10的5次方/ml)，常以单个心肌细胞贴壁生长，可供研究单细胞用；密度为5乘10的5次方/ml，细胞可形成疏松的单层细胞网，其搏动同步化；加大细胞密度，大于1乘10的6次方/ml，培养时间较长，可形成单层细胞或多层细胞，或形成细胞簇，搏动同步化。
  如果条件允许，你可以通过培养不同密度的心肌细胞并对比观察，找出最合适你所需求的细胞密度。6孔板2ml差不多，我想也可以适当加一点。
  对了，消化的掌握非常重要（酶的浓度和时间），酶的浓度要相对低一些，不要消化过度。

• bongte (2012-8-25 15:30:27)

  不同接种密度的文献报道都有，常见的是从10的5次方到10的6次方/ml之间。接种的细胞密度低（<10的5次方/ml)，常以单个心肌细胞贴壁生长，可供研究单细胞用；密度为5乘10的5次方/ml，细胞可形成疏松的单层细胞网，其搏动同步化；加大细胞密度，大于1乘10的6次方/ml，培养时间较长，可形成单层细胞或多层细胞，或形成细胞簇，搏动同步化。
  
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  再请问我是用药物诱导心肌细胞肥大,接种密度多少合适呢?

• ladyhuahua (2012-8-25 15:31:02)

  
  增加每次的小鼠数量，保证所取得的心肌细胞足量，至少每次3只以上混合培养，24h以后没贴壁的细胞基本没什么用的。

• u234 (2012-8-25 15:31:24)

  
  我养的心肌细胞第一天晃动培养液圆形细胞不动，但没有铺展开，仍是圆的，有碎片，换了液后第二天观察还是有碎片，只有有个别细胞形成三角形，换液，第三天伸展的细胞仍很少，是消化过了呢？还是培养过程有问题？我用ＧＩＢＣＯ胰酶０．０８％，十只红皮鼠，每次六分钟，消化１２次才把组织消化完，完培１５％小牛血清，用ＧＩＢＣＯ的ＤＭＥＭ加各１０万单位的青链霉素，和３．７克ＮＡＨＣＯ３，请哪位高手指点以下迷津

• dragonkilly (2012-8-25 15:31:49)

  我用ＧＩＢＣＯ胰酶０．０８％，十只红皮鼠，每次六分钟，消化１２次才把组织消化完，
  
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  胰酶对细胞的损伤大，对组织分散的作用小。不如用胶原酶消化，其对细胞影响小，能消化胶原组织使细胞分散。

• ququer787 (2012-8-25 15:32:05)

  
  没有贴壁一般是分离过程中的问题吧

• bongte (2012-8-25 15:33:05)

  我养的心肌细胞第一天晃动培养液圆形细胞不动，但没有铺展开，仍是圆的，有碎片，换了液后第二天观察还是有碎片，只有有个别细胞形成三角形，换液，第三天伸展的细胞仍很少
  
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  我一直做也是这样,但是用0.08%胰酶和0.1%胶原酶的混合液消化的,第一天晃动培养液圆形细胞不动,第二,第三天也是圆形细胞不动,但没有看到细胞变形(可能是观察不仔细吧),师姐说是细胞处于静止期,我不同意这个观点,但又找不到原因.最近几次做,和以前的操作条件都一样的,1,5小时差速贴壁后看到很多成纤维细胞贴壁变形了,很是高兴,但24h后,视野中细胞大量减少,虽然能看到心肌细胞跳动,但都只是在平皿边缘有几簇细胞.我当时就想,1.5小时后细胞都贴的这么好了,说明细胞活性很好了,但怎么还做不好呢?我也还在找原因，虽然我还是没有把心肌细胞养好，但还是把我的思考的方面写给大家，大家帮忙看看，我这样考虑对不对？
  １．培养液：我曾用参照了几个战友的配方，但都不行(把培养液放在培养 箱中２４h的PH值都还有7.8左右）,才想到由于各地的水的PH值不同,会有差别的,后来我参考资料和园子里的配方,配了8种培养液,分以下几个时间点测PH值:刚配好(加血清前)测PH值;加血清后测PH值;抽滤后(加血清后与DMEM一起抽滤)测PH值;抽滤后的培养液体用旧的6孔板,每孔分别加2ml培养液,于培养箱24小时后测PH值,及观察颜色;其余的培养液用10ml玻璃瓶分装后封口膜封后,放4℃保存,于24小时测PH值,及观察颜色.最后选用了2.2gNaHCO3 (g/L),5.95gHEPES(g/L).
  2. 污染:我觉得1.5h后细胞就死了这么多,是有污染了吧?但培养液不变浑浊,是有其他霉菌或支原体?但给了老师看,也发了图片到圆子里,都说没有.
  3. 没有用血清及时终止消化?难道是酶没有去除在24h继续消化着细胞?我是用含10%胎牛血清的DMEM终止消化的,取出的上清马上加到了DMEM中,就离心了,离心后的沉淀也马上加DMEM混悬了.所以觉得终止消化应该没什么问题吧?
  4. 消化过度?我到最后,觉得还是消化过程中出现的问题,虽然1,5h细胞活性感觉不错，但细胞是有耐受力的，但随着时间的延长就不行了.
  
  不知道我这样考虑对不对呢?请大家指教!