Li R H , Zhuang L Z. Study on reproductive endocrinology of human placenta. Ⅰ. Culture of highly purified cytotrophoblast cell in serum-free hormone supplemented medium. Sci China Series B , 1991 , 34 : 938
去图书馆查这篇文献。
toy.,不知你手上有没有
Li R H , Zhuang L Z. Study on reproductive endocrinology of human placenta. Ⅰ. Culture of highly purified cytotrophoblast cell in serum-free hormone supplemented medium. Sci China Series B , 1991 , 34 : 938
这篇文献，我们图书馆查不到，你有的话能否给我发一份？谢谢！我的邮箱是 xfq-2005@163.com
最新回复
ha111 (2012-8-28 14:10:48)
1.新的培养板可以，但有时养细胞也可试试换用其它牌子。
2.再培养是不是你胰酶消化细胞过了，另外你是不是细胞数量少，也可影响的。
3.细胞有时要等等有耐心，这瓶如果没有污染等，可使其生长一段时间观察。也许你的细胞就不好。
chuntian1983 (2012-8-28 14:11:22)
谢谢，我有个字说错了，可能你误会了，不好意思！
1、我是原代培养，将组织剪碎，180 ml温浴的含钙、镁的Hank’s液（含25 m MHEPES、180 mg胰酶、15 mg Dnase1、pH7.4），37摄氏度震摇20 min，再加入5 mg Dnase1，再37摄氏度震摇10 min，去除上清。
2、再用0.1%胰酶，15 mg Dnase1消化，每30分钟一过滤，收集每次滤液离心沉淀，重悬。用5%、20%、40%、60%、70%percoll密度梯度离心，去中层细胞。以3乘10的5次方接种于6孔板中，用20%胎牛血清。
3、结果细胞贴壁很少，贴壁的细胞也不展开，形状也没什么大的变化。我做了好多次了，以前不是用这种方法，后来查文献加自己摸索才有这样的效果，很麻烦，但有细胞，现在就是贴壁生长不好，所以后面的实验一直还没做，急死人了，不知到有没有人做过这种人胎盘滋养层细胞，没做过的也请多给我些建议，谢谢大家。
lixi559 (2012-8-28 14:11:54)
我想你是胰酶消化过了，建议：
1.用不含钙、镁的Hank’s液，缩短胰酶消化时间，看到细胞分散得差不多了（实体镜下组织出现虚虚的毛刺）就可以终止了。
2.每次过滤后的滤液在离心沉淀前用带血清的培养基终止一下胰酶。
3.人胎盘滋养层细胞的培养具我所之香港中文大学有人做，你也可以查查中科院动物所的王燕灵（音，具体哪几个字我记不得了），她做的不错，查查文章。
人胎盘滋养层细胞我只培养的2次还是很多年前做的，能想起来的就这些了。
skytree (2012-8-28 14:12:23)
请教楼上，何谓实体镜？
chuntian1983 (2012-8-28 14:12:47)
谢谢啦，可是我用不含钙、镁的Hank’s液消化时，组织非常粘，更本就没有滤液，更别说离心得到细胞了。后来看到国外的文献，用的是不含钙、镁的Hank’s液消化，才不粘了，有细胞出来，我用了血清终止消化
skytree (2012-8-28 14:13:30)
组织粘的主要原因据说是大量细胞被消化，释放出的DNA导致的，可以加DNA酶，也可以在终止消化后用Hank’s液稀释一下。
钙、镁离子的存在可以稳定细胞连接，就需要更多的胰酶或消化更长的时间，这样对细胞的损伤也就更大，为了证明这一点你可以在接种前取少许细胞用胎盼蓝染一下，看看死细胞多不多——死细胞多也可能影响细胞贴壁。
如果不是这个原因你就给细胞更多的时间。
toy (2012-8-28 14:14:07)
请教楼上，所加DNA酶是在消化时候与消化酶同时加，还是在消化以后加呢？
chuntian1983 (2012-8-28 14:15:30)
不好意思，上面写错了，应该是：后来看到国外的文献，用的是含钙、镁的Hank’s液消化，才不粘了，有细胞出来，我用了血清终止消化。
我以前用不含钙、镁的Hank’s液消化，也加加DNA酶，但还是粘得很，更本没有滤液，我用含钙、镁的Hank’s液消化，才不粘了，有细胞出来，我用了血清终止消化。接种前用了胎盼蓝染，死细胞多不多，有文献说钙、镁可提高DNA酶活性，以前用不含钙、镁时可能是DNA酶没有起到消化DNA的作用吧，
toy (2012-8-28 14:16:00)
去图书馆查这篇文献。
toy (2012-8-28 14:16:25)
你消化的温度高了，用低温消化可以减少细胞的死亡。
用0.25%的胰酶-PBS在2~8℃消化45分钟，用等体积的培养液终止，加15U/mlDNA酶I消化10分钟，经80目和150目筛网过滤，经1.25~2.5%的BSA密度梯度沉降1小时，收集最下层的细胞滋养层细胞。
chuntian1983 (2012-8-28 14:17:01)
1、这是你亲自做过的吗，我们学校有老师告诉我，低温消化，用的是4度消化，他们都用了大约20到24个小时，低温下胰没酶的活性很低，是一种缓慢的消化，你用45加10分钟行吗？
2、15U/mlDNA酶I量够吗？
经80目和150目筛网过滤是什么意思，是先用80目过滤后，再用150目过滤吗？
经1.25~2.5%的BSA密度梯度沉降1小时是说用1.25和2.5%BSA两个密度吗？是将2.5%BSA铺在下层，1.25%BSA铺在下层吗？
3、我们在用Percoll密度梯度离心时最下层是红细胞，最上层是一些纤维成分等杂质，中层才是滋养层细胞，说明红细胞比滋养层细胞重，那么理论上说，用1.25~2.5%的BSA密度梯度沉降1小时应该是最下层是红细胞的呀？难道你们消化后没有红细胞吗？
4、还有一个问题想请教，就是你们是用的6-10周的流产的胎盘，用剖腹产的胎盘也可以用你这种方法吗？我这里一直都用的剖腹产的胎盘。
5、另外还有一个非常重要的问题，那就是在取材时，你是怎么取的，文献上说挑取绒毛组织，可我做时更本就无法辨认那是绒毛组织，所以我就只将大些的肉眼可见的血管去掉了，将其他的成分混在一起剪碎，用生理盐水洗干净，直到清亮。但在消化后离心后还是有很多红细胞，比滋养层细胞多很多，我想这也是我实验不成功的一个原因。真的很想知道你是怎么取材的，请你指教？
我是武汉大学的，武汉大学改革后我们就读两年，一年已过去了，现在时间真的好紧，很多同学都已经做完了实验，可我还连细胞都没养出来，真是急死了，后面的实验设计也无法落实，现在真的没办法，只有在网上求救，谢谢你一直关注我的问题。
chuntian1983 (2012-8-28 14:17:23)
Li R H , Zhuang L Z. Study on reproductive endocrinology of human placenta. Ⅰ. Culture of highly purified cytotrophoblast cell in serum-free hormone supplemented medium. Sci China Series B , 1991 , 34 : 938
这篇文献，我们图书馆查不到，你有的话能否给我发一份？谢谢！我的邮箱是
xfq-2005@163.com
[求助]请教大家一个细胞培养方面的问题