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[求助]大家帮我看看这有没有凋亡啊！
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大家帮俺看看图片里有没有凋亡啊，我用的是PI和Hoechst 33342双染。细胞是人肝癌7402的细胞株。谢谢了
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48598193.jpg
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-8-31 17:21 作者: ALALA 来源: 分析测试百科网
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最新回复
ALALA (2012-8-31 17:21:28)
再来一张，都变红了。
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ALALA (2012-8-31 17:22:13)
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ALALA (2012-8-31 17:22:29)
这张是AO/EB染色。
45002170.jpg
ALALA (2012-8-31 17:22:46)
这张也是AO/EB染的。
74968421.jpg
rxcc33 (2012-8-31 17:23:18)
就我的观点看，凋亡的效果不是太明显
要点大家都知道，需要看到核碎裂的情况，看看下面的图就很明显了。
参考文献
Vol. 10, 2936–2943, May 1, 2004 Clinical Cancer Research
Synergistic Cytotoxicity and Pharmacogenetics of Gemcitabine and Pemetrexed Combination in Pancreatic Cancer Cell Lines
51625282.jpg
ALALA (2012-8-31 17:23:54)
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ALALA (2012-8-31 17:24:16)
10174789.snap.jpg
ALALA (2012-8-31 17:25:58)
看看我DAPI染色的图片,X160,我有点看不懂,那些核变小,变亮的是不是凋亡,
13719676.snap.jpg
ALALA (2012-8-31 17:26:15)
再来一张X320,
19318004.snap.jpg
qumm1985 (2012-8-31 17:26:39)
最好用同一組細胞同時作flow(pi stain)及dapi(microscope)這樣就可以比較好確定了..如果cell多可以再作個western..
光看一組顯微鏡的結果爭議比較大..且很難客觀去分析..
feima+ (2012-8-31 17:28:32)
PI和Hoechst 33342双染：
正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。
to ggester 战友：
看了你前几张图片被pi红染的细胞，说明细胞已经死亡，需要鉴别是坏死还是晚期凋亡引起的，第一张隐约可见细胞核分裂碎片，核膜完整，应该是凋亡引起的细胞死亡，但你的细胞数太少了，而且后几张也不太典型，超过30%的细胞发生凋亡才可说明问题。
建议：我猜你可能做的是原代细胞的损伤模型吧，因为一般细胞株药物诱导凋亡， PI和Hoechst 33342双染可见满眼的凋亡细胞，如jamesxia 所示比较明显。而原代细胞损伤后难于收集，易丢失细胞，我建议你加大细胞接种密度，并且适当延长细胞损伤的时间，收集细胞时格外小心，最好用Hoechst 染色的典型凋亡细胞来说明问题。
TNT (2012-8-31 17:28:50)
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体，请参照此连接中的图片http://www.dxy.cn/bbs/post/view? ... amp;tpg=1&age=0
00无名指00 (2012-8-31 17:29:09)
大家把自己做的图片都发上来吧，一起分析讨论一下。以前有过这样的贴子，但是有些问题还不太清楚。欢迎各位都来讨论一下，讲述一下自己做凋亡的实验经验吧
ALALA (2012-8-31 17:29:46)
正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。
看了你前几张图片被pi红染的细胞，说明细胞已经死亡，需要鉴别是坏死还是晚期凋亡引起的，第一张隐约可见细胞核分裂碎片，核膜完整，应该是凋亡引起的细胞死亡，但你的细胞数太少了，而且后几张也不太典型，超过30%的细胞发生凋亡才可说明问题。
建议：我猜你可能做的是原代细胞的损伤模型吧，因为一般细胞株药物诱导凋亡， PI和Hoechst 33342双染可见满眼的凋亡细胞，如jamesxia 所示比较明显。而原代细胞损伤后难于收集，易丢失细胞，我建议你加大细胞接种密度，并且适当延长细胞损伤的时间，收集细胞时格外小心，最好用Hoechst 染色的典型凋亡细胞来说明问题。
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我是用1000RPM，10min收集的细胞，不只能不能全部收集起来啊？我用的是高倍镜看的，所以细胞比较少，用低倍的好像看不太清楚。
windy+++ (2012-8-31 17:30:13)
Nuclear morphology was assessed using Hoechst 33342 and PI staining. KYSE 270 cells were incubated with 10 μM of TRO and/or 5 μM of 9CRA for 24 h. Cells were harvested and labelled with Hoechst 33342 (5 μg/ml) and PI (2.5 μg/ml) at 37 °C for 10 min. The cells were examined by fluorescence microscopy according to the method previously reported in Ref. [27]. Intact blue nuclei, condensed/fragmented blue nuclei, condensed/fragmented pink nuclei, and intact pink nuclei were considered viable, early apoptotic, late apoptotic and necrotic cells, respectively. Morphological analysis was performed in duplicate. The percentage of viable, apoptotic, and necrotic cells were represented out of a total of 1000 cells counted
Fig. 5. Morphological changes of cells simultaneously treated with troglitazone (TRO) and 9-cis retinoic acid (9CRA). The cells were harvested and stained with Hoechst 33342/PI. Cells with blue intact nuclei were viable, whereas those with blue fragmented nuclei were early apoptotic. Cells with pink intact nuclei were necrotic, whereas cells with pink fragmented nuclei were late apoptotic. The photomicrographs were taken at a ×400 magnificat
个人认为这种方法很好，很容易区分坏死，凋亡早期，凋亡晚期，活细胞。另外pi染色得时候要特别注意时间，否则会对染色造成很大影响，有一次，我没有洗掉pi，原用有pi的染色液在显微镜下观察，结果，同一个细胞在一分钟之前和一分钟之后的染色深度都完全不一样，所以时间和温度应该是相当重要的。
ALALA (2012-8-31 17:30:31)
请问楼上，你用hoechst 33342 和PI染色的时候是一起染的，还是分开染的？染完色还要把PI洗掉吗？我都是没有洗，直接去荧光观察的，颜色变得很快，本来还有很多兰细胞，一会就都变成红色的了。为什么啊？我是不是应该洗掉PI然后再去观察啊？
刚开始做不久，请多指教。
windy+++ (2012-8-31 17:30:54)
yeah,是一起共染的，都是10分钟，37度，染完后必须洗掉，换新鲜的PBS，荧光观察，否则就会像你看到的，颜色变得很快，甚至是10几秒钟颜色都会变化。另外我用的是33258。
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