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[求助]细胞冻存失败
贴壁细胞冻存。[求助]细胞冻存失败
冻存液分别为5%和10%DMSO，剩余成份为已配好的含20%新生牛血清（hyclone）的培养基。将两瓶细胞传代，然后合至一瓶，计数，离心去上清，加入适量的冻存液，终浓度大约8-9*106。
冻存程序：4度30分，-20度30分，-80度过夜（24h以内），然后液氮保存两天后复苏。复苏时把冻存管取出后套在泡沫塑料上浸入水中融解（室温），耗时1分多完全融解。超净台内将细胞液转移至5ml离心管中，先加入大约3.5ml10%培养基，吹打均匀后离心弃上清，再加入少量20%培养基吹打均匀，转移至培养瓶中，补加20%培养基至10ml/瓶。
复苏半天后观察，发现大约已有50%细胞贴壁，死细胞不太多，两个浓度DMSO都差不多。然后每天观察两次，发现细胞不怎么长，死细胞渐渐增多，单层细胞慢慢脱落，到现在单层虽然脱落的不是很多，但这样下去细胞迟早会挂掉。冻存之前细胞生长非常旺盛，不知为何冻存后竟然如此。请各位高手看看实验操作有没不对的地方，帮我分析一下到底是何原因。
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最新回复
yhz1973 (2012-9-01 12:49:43)
提点建议，供参考：
1. 冻存速度过快，无程序降温仪的土法冷冻应该是：4度20分钟后将细胞冻存管放在泡沫塑料盒子内，-20度4小时，-80度过夜（24h以内），然后液氮保存，关键在“泡沫塑料盒子”的保温作用使细胞缓慢降温。
2. 复苏后DMSO未完全透出，（注意：DMSO是透出而不是洗出）洗一次只是洗去细胞外的DMSO，正确的方法应该是：在冰浴中加等量Hanks液，每隔5-10分钟加一倍量的Hanks液（倍比稀释），至少4次后离心洗去，换培液再洗一次后培养。
tuuu2 (2012-9-01 12:50:52)
看了一下楼主的protocal，感觉好像没什么问题。我们实验室-20度是放2小时的，但是有时从4度直接放到-80度的也没有什么问题；
复苏时候，可能你要将冻存管立即投入预热好的水浴中，并不停地摇晃，让其尽快复温；
试着多冻一些，复苏后，许多贴壁细胞系需要较高的密度才能很好生长。
唉，没有更多的经验了。
不知道是什么细胞，楼主应该交代一下，知道的战友可以更好地参与讨论。
66+77 (2012-9-01 12:51:19)
复苏应该是37-40度，你的问题可能出在室温上。
langlang (2012-9-01 12:51:48)
+++++++++++++++++++++++++++++++
怎么个套法？隔热了？
室温？现在室内20多度吧？太低了
dragonkilly (2012-9-01 12:52:09)
复苏时把冻存管取出后套在泡沫塑料上浸入水中融解（室温），耗时1分多完全融解。超净台内将细胞液转移至5ml离心管中，先加入大约3.5ml10%培养基，吹打均匀后离心弃上清，再加入少量20%培养基吹打均匀，转移至培养瓶中，补加20%培养基至10ml/瓶。
你throw cell的步驟太複雜了...cell在這環境一下不太開心..
cell拿出來後放在37度溶..把他吸出放在culture dish上,,吸10ml medium 慢慢加在cell上, 一邊加一樣搖晃, 使cell與medium能充分混合, 最後再pippet一次..放會incubator內,,這樣3分鍾都不用..細胞也開心..隔天再換一次medium
不用擔pdmso的問題...在freeze cell時0.5~1ml cell含10%dmso...throw後在10ml medium下只有1%...這對細胞絕對沒問題,,隔天再換一次medium..把dmso洗掉..這樣動作就很快...
66+77 (2012-9-01 12:52:41)
非常感谢诸位的帮助，我养的细胞是一种鱼类细胞，最适生长温度在22度左右，所以复苏时才用室温。没交代清楚，不好意思。
另外有些问题烦请楼上不吝赐教。-20度4小时是不是有些太长了呢？看过的一些参考书建议-20不超过一小时。还有复苏后透出DMSO的步骤为何要在冰浴进行，细胞已经回温再次低温会不会有害呢？难道仅仅因为DMSO低温时毒性小吗？
。
66+77 (2012-9-01 12:53:07)
我会参考诸位的建议，争取尽早把细胞搞定
园丁## (2012-9-01 12:53:37)
细胞程序降温仪设定的是0.3度/分钟（从0~ -80），-20度应该是1小时，我打错了，抱歉。
透出DMSO的步骤要在冰浴进行就是因为DMSO低温时毒性小。DMSO的细胞毒性与温度密切相关，也因为此特性才应用其作为冻存保护剂。
“细胞已经回温再次低温会不会有害呢？” 其实细胞复苏的程度是完全融解，并非复温到37度，而融解后的细胞悬液和冰浴的温度是接近的
pencil菲 (2012-9-01 12:54:05)
我们直接用胎牛血清，不用含胎牛血清的培养液。
caihong (2012-9-01 12:54:31)
可以尝试：
复苏时将冻存管直接放入37度水浴锅，一旦细胞化开马上用培养基稀释冻存液
我们做下来效果不错
66+77 (2012-9-01 12:54:55)
复苏时多离心几次 损失点细胞没什么 把DMSO去干净。 还有 复苏之后每天都换一次带血清的培养基,坚持一星期再看会怎样。
TNT (2012-9-01 12:55:47)
wsll (2012-9-01 12:56:10)
提高胎牛血清的浓度，50％以上效果较好，再者加冻存液时注意在冰内慢慢滴加，我感觉你其他步骤无啥问题。
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