[求助]如何分离人外周血中的有核细胞

最新回复

• yhz1973 (2012-9-01 13:49:15)

  
  用淋巴细胞分离液来分吧，
  你在版块里面search一下，
  很快就能得到答案的！

• wanglaoshi (2012-9-01 13:49:46)

  
  如果想收集除了红细胞外的所有细胞，还是用红细胞裂解液好。淋巴细胞分离液只能收集单个核细胞，多核的粒细胞会损失。而且效率还不高。

• DDD (2012-9-01 13:50:22)

  
  红细胞裂解液
  不好控制，使用不当，就把其它细胞搞死了，分离骨髓间充质干细胞时候使用过，效果很差
  要求不高的话还是用淋巴细胞分离液

• vvmmoy (2012-9-01 13:50:50)

  外周血单个核细胞的分离
  
  　　外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
  
  　　（一）Ficoll分层液法
  
  　　主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图20-1）。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

  
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• vvmmoy (2012-9-01 13:52:25)

  （二）Percoll分层液法
  
  　　这是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75％)，下层富含淋巴细胞(98％)(图20-2)。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法，但操作流程较长，手续较多。

  
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• ha111 (2012-9-01 13:53:10)

  
  你现在找到好的方法了吗，我刚做完相关试验，分离的是人外周血中性粒细胞，根据不同的细胞，细胞分离技术也是大相径庭，你可告诉我你要分离哪种细胞。我跟你探讨一下。

• ladyhuahua (2012-9-01 13:53:30)

  
  分离液你可能一定要用的，我刚做完类似试验，如果你不想让细胞受到很大损伤就不要用红细胞裂解液，我分离的是淋巴细胞和中性粒细胞。所以大部分的有核细胞基本上都得到了。下面是我的分离步骤，牵涉到两种细胞分离液，一种是淋巴细胞分离液，另一种是挪威产的很贵的一种也很好的分离液，也能用来分离细胞器，细胞膜等结构叫OPTIprep的分离液我还有剩，这种分离液对细胞活性几乎没有损失，国内买很贵的。你只需用OPTIprep配成密度为1.095的分离液，就能达到目的的。看一下我的步骤把应该对你有帮助。
  分离的关键是：一、抗凝要好
  二、分离液梯度配的技巧要好
  三、最最关键的就是离心机，不能只根据转速，一定要根据不同的离心机掌握转速，多试剂次就摸出经验来了，大约就是800g 。时间20min左右
  
  1、门诊抽血，无菌操作，4%EDTA 0.2ml抗凝4ml全血，吸管吹打，迅速移送实验室进行试验
  2、同体积Hank’s液稀释，混匀。
  3、取5×15离心管准备密度梯度分离液：下层：密度为1.090g/ml 的Optiprep分离液，上层：密度为1.077g/ml的淋巴细胞分离液。分离液总高度约为6cm左右
  4、每份血分成两等份放入3中分离液的上面。配平离心管，水平离心机上2500转18~22℃离心25min。
  5、吸管吸取分层的中性粒细胞层，2-3倍Hank’s液稀释。
  6、18~22℃ 1000转离心5分钟
  8、冰水破坏残留红细胞，再用Hank’洗涤2次，体积定为2ml，计数板显微镜下计数。
  9、细胞悬液成106cells/ml，并加入1mg/ml HAS（人血清白蛋白）。

• viviwang1987 (2012-9-01 13:54:01)

  
  非常简单，可以用6％Dextran沉降红细胞（1：4混匀），沉降40分钟，吸出上清，离心后用蒸馏水裂解红细胞，PBS洗去血小板，剩下的就是全部的外周血有核细胞了，我最近一直在做，效果很好，而且操作比较简单。
  楼上各位说得方法大都只能分离白细胞的某种成分，而不是全体白细胞。