[求助]细胞复苏失败

最新回复

• one (2012-9-01 14:22:43)

  QUOTE:

  原帖由 kuohao17 于 2012-9-1 14:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  肝癌细胞SMMC7721复苏失败，请那位高手指点迷津！谢了

  http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1322275_0.html

• moonlight45 (2012-9-01 14:23:18)

  
  第一：你应该讲讲你的过程，是如何失败的？
  第二：我们复苏的时候，是这样做的。
  1.细胞从-80度或液氮中拿出来后，直接放到37度水浴，快速融解后（中间要晃动，不要等到细胞也达到37度，4度左右就可以了）
  2. 把细胞放到冰上操作，使用的培养基也要求在4度，包括随后的离心也是4度。
  3. 接种细胞于4度培养基在放入37度培养箱。
  这样复苏的细胞成活率高点。
  第三：你的细胞储存在什么条件，多长时间了，冻存前的状态如何？这些都可以影响到你的复苏。
  
  希望对你有用。

• lixi559 (2012-9-01 14:23:32)

  
  我觉得细胞应该慢冻速融.我们这里的方法和主任有点不一样,我们在37-42度水中细胞融解后就直接加含有10%血清的培养基,不过这个培养基必须预热到37度,离心也不必低温,常温就行了.

• wu11998866 (2012-9-01 14:23:50)

  
  我常用的方法是：细胞从液氮取出后，37度水浴中速融后离心（4至8度），再加入含有10％血清的培养基。注意整个过程在10分钟内完成，最好不要超过15分钟。
  不妨试试，祝你成功！

• qumm1985 (2012-9-01 14:24:10)

  
  1 确保你的培养液是可用的，譬如养其他细胞还可以。
  2 自己再复苏一次，复苏的时间尽量要短，每2-3小时观察一次，看看细胞的形态学变化。
  3 如果还不行，可以让你傍边细胞培养技术比较熟的师兄帮你复苏一下。（有时，由于各方面的原因，冻存的细胞都已经不行了，别人复苏也可能回天乏力。）

• 101010 (2012-9-01 14:24:25)

  
  你的问题可能与复苏无关，可能冷冻过程出了问题。我觉得－80度的细胞冻存时间不能太长。

• qumm1985 (2012-9-01 14:24:43)

  首先,可能你所复苏的冻存管本身就存在问题,可能在上次实验冻存时就有问题.具体如下:
  1. 冻存时机不好：2. 细胞量不够：3. 没有按照慢冻原则.
  其次,讲讲复苏过程中可能出现的问题
  复苏应该迅速,一从液氮中取出应立刻置于37度中水浴.后离心,去上清液,加培养液.
  具体的操作中应该注意操作的无菌.
  你可以尝试换瓶培养液(你上回用的液体存在污染的可能性),同时可以叫位有经验的人在旁边看看.因为有些操作自己比较容易忽视,旁观者可以更清楚的指出.
  你可以把具体的实验情况多讲点,以便我们一起探讨分析.
  希望对你有所帮助.

• utt0989 (2012-9-01 14:24:59)

  
  建议复苏细胞后取样，用台盼蓝染色计算活细胞率，以确定冻存细胞本身有无问题。

• kuohao17 (2012-9-01 14:25:19)

  
  非常感谢！我想是我复苏的时间太长的缘故。谢了

• dongdongqiang (2012-9-01 14:25:42)

  冻存和复苏细胞对与细胞的保存非常重要，都要讲究快。
  冻存液建议用90％的血清和10％DMSO效果好。
  冻存时，速度要快，最好在加入冻存液1分钟之内将细胞冻存。-80度可以放一年一点问题没有。
  复苏时，用37－45度的水，尽量让细胞迅速度过5度，5度左右对细胞是有损害的。细胞一定要洗至少一遍，DMSO对细胞是有损害的。

• bananapeople (2012-9-01 14:26:01)

  
  "我常用的方法是：细胞从液氮取出后，37度水浴中速融后离心（4至8度），再加入含有10％血清的培养基。注意整个过程在10分钟内完成，最好不要超过15分钟。"
  时间太长了，2分钟搞定的把，太长了细胞活力不行了

• eric930 (2012-9-01 14:26:24)

  
  同意楼上的方法，DMSO一定得去处干净，用1640洗两遍也可以的，再加培养液！因为是刚复苏的细胞，观察一星期状态会恢复的，别太着急了，要给他一个恢复时间。祝你好运！

• orangecake (2012-9-01 14:26:44)

  
  我们在37-42度水中细胞融解后就直接加十倍的含有10%血清的培养基,800rpm，4min，培养基必须预热到37度,离心也不必低温,常温就行了。在加入培养基后转移到细胞瓶中再培养就可以了，可以隔天换液。

• summerxx (2012-9-01 14:27:02)

  1.37度水浴中速融
  2.提前在15ml离心管中放好10ml完全培养基，将融化的细胞冻存液吸入。
  3.800~1000rpm离心6~7min
  4.倒掉上清
  5.将沉淀用5ml完全培养基悬浮（动作要轻），转移到培养平中。
  个人觉得提高培养基中血清浓度和不使用抗生素效果要好
  另外，细胞冻存于-80度冰箱中活性改变较快，最好-80度过夜后及时转入液氮。还请注意液氮罐中液氮的量，及时添加新的液氮。