[求助]HANKS(高压消毒后出现沉淀）配制多次失败...

最新回复

• wood533 (2012-9-01 16:39:26)

  
  是不是这种问题是很那个呀，不论怎么样，自己先顶起来。继续求助

• yueban-1147 (2012-9-01 16:39:49)

  注意：1.所用的试剂要纯
  2.试剂要逐个的溶解，按配方中顺序加入，以免化学反应产生沉淀
  3.溶液2加入溶液1时，缓慢
  4.高压灭菌不要超过10磅（10-15分钟），以免葡萄糖破坏
  5.NaHCO3用来调节PH，酚红是指示剂，有较小的缓冲作用

• wood533 (2012-9-01 16:40:09)

  
  谢谢各位已经搞定
  cuturl('http://cache.baidu.com/c?word=%B0%F5%2C%D3%A2%B4%E7%2Cpa&url=http%3A//www%2Eoilchina%2Ecom/syswsc/sydwhs/swsc%5Fswsc%2Ehtm&b=0&a=2&user=baidu')

• HP007 (2012-9-01 16:40:26)

  
  我个人认为微孔过滤效果会好很多，因为里面有氨基酸等营养物质。至于葡萄糖,可能高压灭菌是有问题,因为我有次配置含葡萄糖的PBS，灭菌后（20min，121度）拿出来后就变成淡棕色了。

• fei1226com (2012-9-01 16:40:49)

  
  我曾经出现这样的问题,查文献后,发现是,葡萄糖高压时间太长,炭化导致,建议121磅.15分钟.

• wood533 (2012-9-01 16:41:09)

  
  今天上去又做了一次，方法同前，没有加葡萄糖，
  8磅 112度 压力: 0.06389MPA 10分钟
  这次不是黄色了，但仍然产生沉淀，我晕晕晕呀。
  请大家说说你们的配方和配置过程吧，对了我配制的是HANKs
  
  郁闷

• 66小飞侠 (2012-9-01 16:41:32)

  
  别高压了，越高压，越复杂，我们的HANKs全都是过滤除菌的，虽然麻烦一点，但绝对不会出现沉淀。
  另外注意一点的是将CaCl2与其它组分分开溶解，即将CaCl2溶解后，再与溶解好的其他组分混合，否则将CaCl2与MgSO4混在一块溶，溶解一开始，由于Ca2+和Mg2+局部浓度大，很容易产生沉淀。
  还有就是配置过程中最好是待前一组分溶解后，再加后一组分。

• moonlight45 (2012-9-01 16:41:49)

  
  我的意见是：一定要按照一定的次序加入，我以前的配的时候也出现过这样的问题，后来找了本比较权威的配试剂的书，并严格按照书上说的方法配制，再高压灭均，就ok了，一点沉淀也没有。我认为那些试剂如果不按照一定的次序加入，他们之间肯定有反应，生成沉淀。因此，按照次序加，可以避免这一点。这只是鄙人的一点浅见！

• wood533 (2012-9-01 16:42:08)

  
  谢谢各位，我是按照司徒老先生的书里的配置方法做的，是严格按照一个熔了在熔下一个。单是，实在是没办法呀，郁闷呀
  好邪门呀，陪液体陪了好几天，晕
  大家谁有配置的详细的程序呀，可不可以帖出来分享一下呀，。楼上说的是什么书呀？
  8磅（ 0.06389MPA）消毒得到 112度的温度
  时间10分钟
  你们是这样吗？？？？
  感觉自己的操作不可能有问题的呀。

• abc816 (2012-9-01 16:42:51)

  
  其实按照配方一一溶解，过滤除菌就好了。别高压灭菌了。

• wood533 (2012-9-01 16:43:08)

  
  我就不信邪，一定要搞出来，别人有的加葡萄糖都可以。要是换别的方法当然可以，但是那不是给自己留下遗憾吗，连HANKS都搞不定，叫人笑。痛苦但要强

• cj_mondy (2012-9-01 16:43:26)

  
  转贴 我也一直用司徒镇强《细胞培养》中的配方配制了Hanks平衡液啊，没有沉淀啊，你要好好搅拌呢！
  常用平衡盐（BSS）溶液（g/L）
  PBS Hanks D-Hanks
  NaCl 8.00 8.00 8.00
  KCl 0.20 0.40 0.40
  CaCl2 0.14
  MgCl2*6H2O
  MgSO4*7H2O 0.20
  Na2HPO4*H2O 1.56 0.06 0.06
  Na2HPO4*2H2O
  KH2PO4 0.20 0.06 0.06
  NaHCO3 0.35 0.35
  葡萄糖 1.00
  酚红 0.02 0.02
  用品
  1、 天平、烧杯、量筒
  2、 NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、MgSO4、Na2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、酚红、三蒸水
  3、 步骤
  在配制时主要防止钙盐、镁盐及磷酸盐的沉淀，现以Hank’s液为例：
  （1） 按表中Hank’s液各成分的含量准确称量。试剂含水分子时可根据具体含水分子的量进行换算后再称量。
  （2） 先将CaCl2溶于100ml水中。
  （3） 依照将其他成分逐个溶解于800ml水中。溶解时必须待一个试剂完全溶解之后，再加入下一个试剂，直至所有试剂溶解后混匀。
  （4） 酚红用数滴5.6% NaHCO3将之溶解。
  （5） 缓慢将100ml CaCl2液（2）倒入于（3）中，搅动，防止沉淀。
  （6） 将酚红液（4）加入到（5）中。
  （7） 补加水至1000ml混匀。
  （8） 将混匀Hank’s液分装盐水瓶内，8磅10-20min高压蒸汽消毒灭菌，4℃冰箱内保存备用。
  （9） 用水配制7.4% NaHCO3溶液，过滤除菌，分装备用。
  （10） 用无菌NaHCO3溶液调节Hank’s液pH值至7.2-7.4。
  
  你可以参考

• wood533 (2012-9-01 16:43:50)

  晕，我就是这么做的，今天了隔壁实验室的同学，他们作过，可是他们也说不出所以然来，明天去他们实验室，在他们实验室请他们看着做一次
  谢谢楼上各位

• langlang (2012-9-01 16:44:13)

  
  配方和操作步骤都没问题，但有时用的试剂可能含有杂质，肉眼看不出来，高压后会产生沉淀，可以试试我的方法：
  1、酚红的溶解　可以加少许1M的NaOH在研钵中研磨溶解，静置5分钟后，上清液加入装有普通滤纸的漏斗中过滤，余下的沉淀继续研磨直到全部溶解。
  2、CaCl2完全溶解后在最后加入，加入时应不断搅拌。
  3、所用的三蒸水应该是已经过高压灭菌的三蒸水
  4、补加完灭菌的三蒸水至要求后，混匀，混匀的Hank’s液分装前一定要用普通滤纸过滤到盐水瓶中，然后于121度高压15分钟。4℃冰箱内保存备用。
  祝你成功！

• 8964357 (2012-9-01 16:44:29)

  
  你用过进口的HANK'S吗？不可以湿热灭菌，可以过滤除菌
  因为NaHCO3遇热分解，在121度时完全分解成Na2CO3、水和CO2，造成PH上升而
  CO2与Ca离子反应生成CaCO3沉淀。
  你可以取一部分上面所说的HANK'S通入无菌CO2，如果沉淀溶解，说明就是因为湿热灭菌造成NaHCO3分解所至，如果沉淀不溶解，则可能是容器具不干净造成，建议你用泡过酸的。因为器具不干净造成的缓冲液沉淀我以前遇到过。
  另外，你最好在溶解酚红时不加NaHCO3,酚红用量可以用配方中的一半，不就是个指示剂吗？干什么加那么多，看看进口的试剂，指示剂的用量全是你那个配方的一半！！
  re:我经常配制各种培养基和缓冲液，所有加NaHCO3的即使在4度时过滤除菌时都产生CO2气体

• wood533 (2012-9-01 16:44:51)

  谢谢！我用的是双蒸水，也没有过滤，如果这样我怀疑自己所用的物质可能不纯
  我会试试。但是我相信过滤以后HANKS的成分的含量会减少，那时的HANKS。。。。。？

• wood533 (2012-9-01 16:45:26)

  我没用过进口的。
  我的瓶子全部是泡过洗液的。值得试试，好方法，谢谢，看看到底是不是
  NaHCO3在做鬼。个人认为这种逆反应的可能性小，不可能把沉淀消除。
  
  谢谢楼上各位战友的支持与帮助
  我想请教一下，咱们在高压蒸汽灭菌时，瓶子里的液体应该还是液体状态吧？如果按照培养基的情况我想应该是这样。？？？
  
  我把大家的意见综合了一下，大家看看：
  HANKS:Standard(g/l):
  Inorganic Salts
  CaCl2 2H2O 0.185 (CaCl2 0.14)
  KCl 0.40 0.40
  KH2PO4 0.06
  MgSO4 7H2O 0.20
  NaCl 8.00
  NaHCO3 0.35
  Na2HPO4 0.048 (Na2HPO4 *H2O 0.06)
  Other Components
  D-Glucose 1.00
  Phenol Red 0.01
  用品
  1、 天平、烧杯、量筒
  2、 NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、MgSO4、Na2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、酚红三蒸水
  3、 步骤
  在配制时主要防止钙盐、镁盐及磷酸盐的沉淀，现以Hank’s液为例：
  （1） 按表中Hank’s液各成分的含量准确称量。试剂含水分子时可根据具体含水分子的量进行换算后再称量。
  （2） 先将CaCl2溶于100ml水中。
  （3） 依照将其他成分逐个溶解于800ml水中。溶解时必须待一个试剂完全溶解之后，再加入下一个试剂，直至所有试剂溶解后混匀。
  （4） 酚红用数滴5.6% NaHCO3将之溶解。
  （5） 缓慢将100ml CaCl2液（2）倒入于（3）中，搅动，防止沉淀。
  （6） 将酚红液（4）加入到（5）中。
  （7） 补加水至1000ml混匀。
  （8） 将混匀Hank’s液分装盐水瓶内，8磅10-20min高压蒸汽消毒灭菌，4℃冰箱内保存备用。
  （9） 用水配制7.4% NaHCO3溶液，过滤除菌，分装备用。
  （10） 用无菌NaHCO3溶液调节Hank’s液pH值至7.2-7.4。
  注意事项：仪器全部清洗干净（泡酸处理）
  1.所用的试剂要纯
  2.试剂要逐个的溶解，按配方中顺序加入，以免化学反应产生沉淀
  3.溶液2加入溶液1时，搅拌并缓慢
  4.高压灭菌不要超过10磅（10-15分钟），以免葡萄糖破坏
  5.NaHCO3用来调节PH，酚红是指示剂，有较小的缓冲作用
  6. 葡萄糖高压时间太长,炭化导致棕色,建议121度.15分钟
  7. 微孔过滤效果比较好（或葡糖糖可以过滤除菌加入）
  8. 8磅 112度 压力: 0.06389MPA 10分钟 1磅力/英寸2（psi）=6.895千帕（kPa）=0.0703千克力/厘米2（kg/cm2）=0.0689巴（bar）=0.068大气压（atm） 1英寸（in）=2.54厘米（cm）
  9.如果CaCl2与MgSO4混在一块溶，溶解一开始，由于Ca2+和Mg2+局部浓度大，很容易产生沉淀
  10．酚红的溶解　可以加少许1M的NaOH在研钵中研磨溶解，静置5分钟后，上清液加入装有普通滤纸的漏斗中过滤，余下的沉淀继续研磨直到全部溶解。
  11.所用的三蒸水应该是已经过高压灭菌的三蒸水
  12.补加完灭菌的三蒸水至要求后，混匀，混匀的Hank’s液分装前一定要用普通滤纸过滤到盐水瓶中，然后于121度高压15分钟。4℃冰箱内保存备用。
  13.进口的HANK'S：不可以湿热灭菌，可以过滤除菌（NaHCO3遇热分解，在121度时完全分解成Na2CO3、水和CO2，造成PH上升而CO2与Ca离子反应生成CaCO3沉淀。验证方法：取一部分上面HANK'S通入无菌CO2，如果沉淀溶解，说明就是湿热灭菌造成NaHCO3分解所至，如果沉淀不溶解，则可能是容器具不干净造成，建议你用泡过酸的。因为器具不干净造成的缓冲液沉淀另外，最好溶解酚红时不加NaHCO3,酚红用量可以用配方中的一半。各种培养基和缓冲液，所有加NaHCO3的即使在4度时过滤除菌时都产生CO2气体
  
  已经收藏并计划重做，一定可以成功

• 园丁## (2012-9-01 16:47:28)

  
  提一下我的看法:
  1. "试剂含水分子时可根据具体含水分子的量进行换算后再称量。"是错误的,因为<MgSO4 7H2O 0.20>的含义就是含7分子水的硫酸镁200mg.
  2. Hanks的沉淀主要是碳酸钙,所以必须在高压灭菌后加入NaHCO3溶液,我注意到你的步骤中" 酚红用数滴5.6% NaHCO3将之溶解。"其中的NaHCO3就可以产生沉淀.

• jkobn (2012-9-01 16:47:44)

  
  过滤除菌

• vvmmoy (2012-9-01 16:48:05)

  
  建议将CaCl2和MgSO4配制成储液,高压灭菌备用.用时加入稀释,需要注意的是,一个加完后摇一下再加另外一个.葡萄糖建议也配制成储液,低压0.05Mpa灭菌15分钟,用时加入.