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[求助]做MTT的细胞密度
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我养的是淋巴瘤细胞Jurkat、Raji，属于悬浮细胞，体积比较小，准备做MTT，但不知道96孔板里每孔的细胞数是否也和贴壁细胞一样，是10*3~10*4？每孔体积是100ul还是200ul比较合适？如果这样的话，细胞密度只有0.5-1*10*5，会不会不够密，影响细胞生长？
我是否需要先以不同的细胞密度接种到96孔板中，做一个MTT看看细胞生长情况，再确定实际接种的细胞密度？具体应该如何确定？
谢谢！！
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最新回复
04906 (2012-9-09 11:30:57)
QUOTE:
在96孔板中加200ul比较合适，细胞的密度一般取10*5memory (2012-9-09 11:31:16)
memory (2012-9-09 11:31:33)
如果要用测不同接种细胞数条件下的生长曲线，具体应该如何进行？如何确定每孔最佳的接种细胞数？
dotaaa (2012-9-09 11:31:56)
对呀,你可以自己摸一摸!
october7 (2012-9-09 11:32:52)
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10*5个/ml
memory (2012-9-09 11:33:13)
我是做细胞对药物敏感性的测定。细胞接种到96孔板后，是马上加药，还是培养几天再加药？
leifengta (2012-9-09 11:33:41)
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两种都可以，关键是对照设好了就可以的。
细胞的指数生长时间是多少，如果4天以后才开始呈指数生长，那还是培养几天再加药比较好，如果在3天之内就开始指数生长了，那两种都可以的。
可能要摸索1~2次吧，你就有点感觉了。
utt0989 (2012-9-09 11:34:33)
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如果是贴壁细胞我一般是种完细胞24h后加药，种时100微升，24h后加药，让细胞充分贴壁，一般每孔200微升，。如果是悬浮细胞可以直接加药，种时就种200微升。至于细胞密度，数量级一般是每孔10 的3次方级，根据你药敏试验测定的天数细胞密度会有所变化。建议你，做一系列的细胞密度梯度，顺便做一下培养时间梯度，一般做24、48、72、96h，根据这两个梯度的结果最终确定你的适宜培养密度。很容易做的。
memory (2012-9-09 11:35:33)
谢谢楼上的各位,但我现在最迷惑的就是,如何根据所得的数据确定最适宜的密度与时间?也就是说,什么算是最适宜?可以具体说明一下吗?
另外,请问楼上的战友,你所说的做细胞密度梯度及培养时间梯度,都是用MTT检测吗?
utt0989 (2012-9-09 11:35:58)
另外,请问楼上的战友,你所说的做细胞密度梯度及培养时间梯度,都是用MTT检测吗?
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你的实验就是MTT，做条件实验的时候肯定也是用MTT检测啊，只不过不加任何外界刺激因素。另外，关于最适宜密度问题，我的看法是如果种的密度太大，等加MTT收细胞的时候，空白对照太满，细胞增殖与时间不成关系，会影响实验结果，如果种的太少同样会影响实验结果。我测的是595nm处的光吸收值，一般对照组72h 的光吸收值接近1，但不能超过1。我的实验只做到72h ,不做96h 的，为了节省培养基，我从加药到72h中途不换液，但也有文献报道要换液的。
lixi559 (2012-9-09 11:36:43)
请问各位,我用的是脾淋巴细胞,悬浮细胞作MTT时,96孔板怎么离心,不离心行么
gogo (2012-9-09 11:37:16)
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悬浮细胞是肯定需要离心的，因为你要吸弃上清液进行比色。至于这种机器尚未用过。
ffooll (2012-9-09 11:37:46)
1. 淋巴细胞要求密度大些 一个孔里1-2万个. 算出来就是100,000 /ml
2. 药物的浓度和培养/刺激时间需要摸条件
3. 96孔板也可以离心的 (大的台式离心机 swing bucket type)
4. Promega的MTT法不需要弃上清,所以用起来更方便些.
memory (2012-9-09 11:38:14)
有战友说过可以用三联液代替DMSO，在悬浮细胞中溶解更好。这之前是否也要离心？
gogo (2012-9-09 11:39:28)
我最近刚做了两个月的淋巴细胞实验。向你提点个人愚见：
首先你要明确你的实验目的：是做药物引起增值还是凋亡抗肿瘤效果？？还是天然细胞因子活性？
园子里这方面的资料很多，但是适合你的需要你自己设计一个小小实验（预实验确定适合你自己实验目的的细胞最佳浓度）：MTT实验因为不同实验条件变化很大，你应该做一个细胞浓度梯度，本人建议包括10*4-10*5，铺板后培养2h以上，等细胞活力恢复后加10ul－20ulMTT,继续培养4h－5h（等你发现低倍显微镜下有大量的雪花样j甲结晶时才可以加裂解液）。我筛选后觉得20%SDS-50%DMF裂解效果好（DMSO更适合贴壁细胞，当然你有专门的离心转子也可以用；三联液的缺点是易起泡，特别讨厌），裂解后吹打几次助碎细胞，37度温育4h或者过夜）。测A570－630值，值在0.70左右的是最适合测药物促进增值或者凋亡的细胞浓度！
祝你好运！！
memory (2012-9-09 11:40:36)
首先你要明确你的实验目的：是做药物引起增值还是凋亡抗肿瘤效果？？还是天然细胞因子活性？
园子里这方面的资料很多，但是适合你的需要你自己设计一个小小实验（预实验确定适合你自己实验目的的细胞最佳浓度）：MTT实验因为不同实验条件变化很大，你应该做一个细胞浓度梯度，本人建议包括10*4-10*5，铺板后培养2h以上，等细胞活力恢复后加10ul－20ulMTT,继续培养4h－5h（等你发现低倍显微镜下有大量的雪花样j甲结晶时才可以加裂解液）。我筛选后觉得20%SDS-50%DMF裂解效果好（DMSO更适合贴壁细胞，当然你有专门的离心转子也可以用；三联液的缺点是易起泡，特别讨厌），裂解后吹打几次助碎细胞，37度温育4h或者过夜）。测A570－630值，值在0.70左右的是最适合测药物促进增值或者凋亡的细胞浓度！
祝你好运！
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万分感谢您的详细讲解,您的意思是不是说如果用在加MTT培养4小时以后,镜下看到结晶,就可以直接加20%SDS+50%DMF,而不需要离心了?但要温育后才能比色,而不能直接进行比色?
我是做药物引起肿瘤细胞凋亡的,要看药物作用24小时后的细胞存活数,这样,正式试验时,是加药后24小时加MTT吗?还是要提早一点?
toy (2012-9-09 11:41:54)
我看文献上写的密度是1～2×10*5。加入的细胞悬液为100微升，再加入100微升不同浓度的药物。在加入DMSO前要用平板离心机离心。
memory (2012-9-09 11:42:25)
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药物要加100ul这么多吗?我还以为是药物体积尽量少到可以忽略呢。
是否不论加什么药物，都是加100ul，我要做单独用药和联合用药的作用，是否加入的总体积都必须是100ul?
memory (2012-9-09 11:42:48)
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请教：是否不论加什么药物，都是加100ul，我要做单独用药和联合用药的作用，是否加入的总体积都必须是100ul? 谢谢！！
gogo (2012-9-09 11:43:10)
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虽然你的疑问贴不是我发的，但以我的理解是：种的时候加100微升细胞悬浮液，保证细胞每孔的数量达到你所要求的数目。然后再补一百微升加药的培养基，使每孔体积达到200微升，DMSO融解药物，浓度大一些便于保存，加药的时候取一些稀释成你要的作用于细胞的浓度的2000倍（每孔培养基的终体积变成了200微升），然后溶解在培养基里，如果是联合用药，就几个药都加在这100微升培养基里。假设我要的作用在细胞上的A药物浓度是2mM，B药物1mM，取4M的A药物0.1微升,2M的B药物0.1微升，都加入到100微升培养基中，即按药物：培养基＝1：1000配制。DMSO在培养基的终浓度最好不要高于0.1％。
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