【求助】细胞冻存

最新回复

• c86v (2012-9-12 15:25:15)

  血清多点对细胞应该是有好处的。应该是可以的。
  我们这里有人建议在冻存细胞的时候用90%的血清+10%DMSO。我知道这样复苏的细胞比10%血清复苏的细胞生长要好。

• HP007 (2012-9-12 15:26:18)

  
  我们这里就用的是40%的胎牛血清，10%的DMSO，效果很好！血清浓度太低不利于细胞存活，所以冻存时可适当高些。另外冻存的细胞最好三个月拿出来复苏一次！

• shenkunjie (2012-9-12 15:26:35)

  我看书上说过：常温下DMSO对细胞有毒副作用，应将冻存液在4度条件下放40到60分钟后使用对细胞损伤小些。

• vcve (2012-9-12 15:26:50)

  
  我培养细胞有4个多月了,也冻存过几次细胞.现在细胞复苏的很好.可以和大家交流下:
  1.血清浓度.开始冻存时也特别关心这问题,在和荷兰一实验室联系时我问到这问题,他们说血清浓度并不是特别重要,可以是10%也可以是90%,但一定要保证DMSO的浓度是10%.我自己也做了浓度实验发现很有道理.
  2.细胞活性.冻存比较重要的是冻存前细胞的活性要好，不然是凶多吉少!
  3.冻存时要保证无菌.这点只要是培养细胞的都会过关,不然你等不到细胞冻存,呵呵,可能你会拼命的扩增呢.
  4.慢冻,快解冻.这要求在有关培养技术的书上都有.
  欢迎交流

• HP007 (2012-9-12 15:27:24)

  根据我们科室细胞培养的经验来说，细胞冻存时冻存液中血清的浓度掌握在平常培养液中血清的浓度的2—3倍即可，血清浓度过高对细胞的存活率应该来说不会有什么不良的影响，由于DMSO在常温下对细胞有剧毒，所以复苏时一定要快，应在1—2分钟内完成。
  特别强调一句细胞培养的关键就在于“无菌观念”。
  最后顺便给你推荐目前国内比较权威的两本有关组织培养的书：
  薛庆善 主编的《体外培养的原理与技术》（科学出版社）
  鄂征 主编的《组织培养和分子细胞学技术》

• 大尾巴 (2012-9-12 15:27:54)

  
  血清多点对细胞应该是有好处的。应该是可以的。
  我们这里有人建议在冻存细胞的时候用90%的血清+10%DMSO。我知道这样复苏的细胞比10%血清复苏的细胞生长要好。
  
  同意

• bongte (2012-9-12 15:28:10)

  
  DMSO对细胞的毒性与温度呈正相关,故在其与细胞接触的全过程均应在4度或冰浴中,冻存前4度平衡20-30分钟是为了让DMSO透入细胞内,这是必须的.

• qqq111 (2012-9-12 15:28:31)

  
  我同意楼上 的说法，可以是10%，因为，我们实验室都是这个浓度的，而且冻的过程也相当简单：细胞用10%血清的培养液重悬后，加入10%的DMSO混匀，立即放到-70度冰箱，第二天取出放到液氮即可。
  我认为，最重要的是所冻细胞的活力要好，冻的密度要适中，不能太稀少，还有当然是无菌了，不然，你将徒劳无功的。切记切记！！！

• qqq111 (2012-9-12 15:37:30)

  
  解冻时我们习惯的做法：取出冻存的管子立即放到37度水浴，待到管中冰即将溶完时（还有少量的），就放到冰浴中，然后进行下一步的工作：在超净台中打开管盖，吸出到5毫升左右的离心管中（目的是尽快西式有毒害作用的DMSO），离心，去上清，然后重悬细胞，移入方瓶培养，即可。

• caihong (2012-9-12 15:37:56)

  
  我们冻存细胞多采用7％或者8％DMSO,这样对细胞的 毒性较小，而冻存效果很好。

• flower-201 (2012-9-12 15:38:17)

  
  我同意楼上的观点,补充一点:解冻时温度40-42度都可以,与许多书上介绍的不一样,因为"冰水混合物 (冻的细胞)"温度较低,但完全溶后就要拿出来.血清浓度要看细胞的娇气程度而言,越娇气的细胞血清浓度越高

• daod (2012-9-12 15:38:35)

  我放假前冻的细胞，想着开学来了就复苏，所以就放在-70度冰箱里，10%的血清，就是在完全培养液中加入10%的DMSO，严格说来血清还不到10%，开学来了复苏非常好，几乎所有细胞都贴壁生长了，第四天就可以传代了。所以我觉得血清浓度好像也不是特别重要。

• qqq111 (2012-9-12 15:38:57)

  你好！
  细胞冻存液含40%血清是可行的。下面是细胞冻存的方法和注意事项：
  1.细胞冻存前 24-48 小时传代培养，应使细胞处于指数生长期；
  2.离心收集细胞，用加血清的培养基悬起细胞， 1-2 × 10 7 /ml ；
  3.另取一离心管，加入培养基、 40% 血清，逐滴加入二甲基亚砜（ DMSO ）至 20% 浓度，即制成双倍的冻存液；
  4.取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液；
  5.将悬液加入灭菌冻管中， 1-2 ml/ 支，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期，立即置 4 度冰箱中， 30 分钟后转入 -20 度冰箱中， 4-8 小时后，再转入 -70 度冰箱过夜后转入液氮中保存（或直接转入液氮中）；
  6.复苏一支细胞，要检测细胞活力及有无污染。
  冻存细胞时注意事项：
  1．细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染；
  2．DMSO 直接加时应缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损；
  3．冻存可用 10%-90% 的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍 20% 终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（ 4 度时），复苏存活率在 80%-90% 以上，对原代培养细胞，以 90% 血清冻存更为有效；
  4．细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤最大，缓慢降温有助于减少损伤，故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便，保存时间过久会影响细胞活力；
  5．细胞冻存后复苏存活率应保证在 80% 以上；
  6．DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用 10% 甘油冻存；
  7．程序降温仪可以更好控制降温过程，但严格按照上述过程操作，可以达到相同的冻存效果。