【求助】培养基为何逐渐变为碱性?

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• tieshazhang (2012-9-14 13:08:30)

  一般而言我的经验是培养基放入箱后PH值是会变小，变酸的。由于细胞的代谢作用也应该是使液体变酸的。你的液体变碱了，虽然浓度显示为5%，我觉得箱子出问题的可能性还是大。毕竟是放进去之后改变的。建议一样空培养基放箱以及放别人箱分别做个比较，看情况怎样，来确定是否培养箱出问题。如箱子问题，可以检查重调浓度。如果不是，特别是放到别人那PH正常了，就要考虑是否细胞问题，不见细胞生长，是否取细胞时没取到或者数量太少。

• KGZ564 (2012-9-14 13:08:58)

  
  感谢！!我的细胞在培养之前用台盼兰染色计数,没有见到被染色的细胞,我接种的密度是2*100000,血清使用的是四季青的胎牛血清,浓度为15%,基培是DMEM/F12。我个人感觉也是培养箱出了什么问题，但是为何浓度显示为５％。可能是哪些方面的问题，请各位老师赐教。

• BUK (2012-9-14 13:13:46)

  
  不知你的培养箱是哪个地方产的，每个培养箱都有一个CO2电子感应器，如果感应器坏了的话，培养箱则失去了控制CO2浓度的能力，显示的CO2浓度的数值与实际值会有差距，你可以试一下你的培养箱。另外，如果培养箱没有问题的话，可以在你的培养基中加点HEPES试试，可以稳定pH值。

• KGZ564 (2012-9-14 13:14:25)

  
  感谢！我的培养箱是美国Forma的，水套式已经使用了６年，最近温度显示也是同样的不稳定，请问老兄HEPES具体应该怎么加．谢谢！

• cj_mondy (2012-9-14 13:14:51)

  我也遇到过同样的问题。我个人认为是由于你使用或者是配置的DMEM/F12缓冲能力较差所致，即使是不加细胞的空白培养基也经常会遇到染色逐渐变深，pH上调的现象，通常我会补加一定浓度的Hepes以增强培养基的缓冲能力；或者最简单的办法就是将培养基瓶或培养瓶盖稍拧松，然后放置孵箱待其自然平至pH7.0－7.2左右即可。由于细胞是宁酸勿碱的，这时要小心你的细胞是否受到影响，是否不再生长？否则的话，及早更换培养基。

• cj_mondy (2012-9-14 13:15:09)

  感谢!我的培养箱是美国Forma的，水套式已经使用了６年，最近温度显示也是同样的不稳定，请问老兄HEPES具体应该怎么加．谢谢！
  
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  不管使用哪一家培養箱,
  定期請廠商回來校正是非常重要的工作.
  建議還是請廠商來看看吧!

• KGZ564 (2012-9-14 13:15:41)

  感谢楼上各位大侠热心相助,培养细胞时我普通的国产培养瓶及进口的六孔培养板都用过，我遇到了同样的问题。另请问各位战友，哪位知道Forma在国内代理商的电话，或其他联系方式！谢谢！

• mamamiya (2012-9-14 13:16:02)

  
  和培养箱的湿度\真实CO2浓度的关系最大,你的箱子很有可能出问题了,比如你可以开一会儿门,反而发现CO2读数上升了.厂家电话可以联系单位设备科,都有备案的

• yes4 (2012-9-14 13:16:27)

  
  可能是你的培养箱的二氧化碳的探头出现故障，显示板指示的浓度不能，你可能联系厂家让它给测一下，你可以单纯用培养基放进去看颜色是否变粉，如变粉，则说明二氧化碳的量少了

• 小荷尖尖 (2012-9-14 13:16:45)

  
  为了具有更好的缓冲能力，我们有时候在培养基里加入一定量的碳酸氢钠（2g/L)。

• KGZ564 (2012-9-14 13:17:23)

  
  请问各位老师除了培养箱的原因,可能还存在哪些因素会使培养基逐渐变碱性?另请问国内哪家公司代理Forma 的产品？Forma 在国内有没有专门的维修服务点，麻烦知道信息的战友告一声，谢谢！

• yysr238 (2012-9-14 13:17:45)

  
  我遇到了和楼主一样的问题，培养箱肯定是没有问题的，我觉得也许是培养液的问题。由于当时配DMEM时，NaHCO3加的太多，加上抽滤时间太长，导致我的DMEM偏碱，细胞不仅不再生长，而且瓶底出现很多颗粒，应该是细胞碎片。我曾经在其中一瓶里加了HCL把PH调到7.5左右，但是培养的细胞仍不见起色，后来又加过一些HEPES，但还是没用。我曾经在园子里看到有帖子说Cl离子对细胞有毒性，所以我打算只加HEPES试试。为了这批DMEM，我真是伤透了脑筋！我就是搞不明白，以前我都是这么配DMEM的，甚至还有忘加HEPES的，就算培养液碱的一塌糊涂，养出来的细胞也都还不错，为什么这次就是不行呢！

• KGZ564 (2012-9-14 13:18:23)

  
  我和楼上的情况以前也是培养得很好的，最近不知什么情况老师培养不成，碰到上面所说的情况，看来真的要高手出马帮忙诊断了，急盼高手出马！

• yychen (2012-9-14 13:19:22)

  
  我跟楼主出现的问题刚好相反
  细胞换液后放在培养箱内，1640培养液一天就变黄。
  我的培养箱上的CO2指数也不是精确的在5%，而是在其左右
  温度也是一样，师兄门说这不影响。

• KGZ564 (2012-9-14 13:19:39)

  
  楼上你的变酸不影响,我的培养基变碱性影响就大了,细胞不成活!!!!

• 一叶 (2012-9-14 13:20:04)

  各位老师有一事求帮忙，我目前在培养肌细胞，使用的生长培养基在放置培养箱前PH值为７．２左右，可是在培养两天后便升到８左右，同时也不见细胞生长，培养在外观上及相差显微镜下均看不到污染的迹象。培养箱的二氧化碳浓度显示为５％，请各位老师看看这可能是什么原因，有没有可能是培养箱出故障了！
  
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  让我们一起来分析分析：
  造成培养液变碱不外乎有以下几个原因：
  
  1。培养液
  2。培养皿
  3。培养箱
  
  其中我认为比较重要的是培养液的缓冲系统：可在每升DMEM和Ham F12混合培养液（1:1）中补加Hepes 15mM或NaHCO3 1.2—2.4克。当然DMEM和Ham F12本身就含有NaHCO3（分别为3.7g/L，1.2g/L ），如果DMEM/ F12的质量有问题（如过期）那也是造成培养液的缓冲系统不稳定的原因。
  
  培养皿的问题主要是瓶盖拧得过紧，这时只要拧松瓶盖就可以了。
  
  培养箱一般不会出什么问题，如果有问题也比较容易诊断出来（把细胞放到其他培养箱中就可以鉴别出来），这时应该及时修理。如果有条件，最好配备有两个培养箱。
  
  hyssp可以从这三方面逐一排除。待问题解决后，在到这里分享你的经验。

• 一叶 (2012-9-14 13:20:49)

  如果楼主找到了培养基变碱的真正原因，希望可以再到这里来写下自己的经验，谢谢！！

• moonlight45 (2012-9-14 13:21:18)

  
  关于配制dmem到底需要加多少碳酸氢钠和多少hepes，各家说法都不一，我觉得这些应该和配好的培养基ph值稳定性有关， gibco的网站上认为，如果培养箱的二氧化碳浓度调到5％的话，碳酸氢钠值只需加到2.2g。hepes推荐加到5.95g（25mm）