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【求助】请教筛稳定株的高手！
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我的细胞3T6 ，转染效率很低，用的是lipofectamine 2000，转染后加G418筛选，几次都得不到阳性克隆。不知道到底问题出在哪里。由于是新手，对于筛株的注意事项及实验方法都不是很清楚。
请各位大侠帮忙！
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-9-14 17:12 作者: 66小飞侠 来源: 分析测试百科网
最新回复
langlang (2012-9-14 17:13:05)
实验的大致步骤是这样：
（1）先摸G418的最佳筛选浓度，最佳浓度应该是加了G418以后的两到三天，部分细胞开始变圆皱缩，到第7天大部分细胞都已经死亡，10天后，细胞全部死亡；
（2）转染就是按照lipofectamine 2000提供的protocol进行，对于细胞密度，DNA用量就按protocol建议的量；
（3）转染后24小时，按1：10，1：20，1：40传代到10cm dish，第二天加G418
（4）每隔3-4天换液（含G418），直至隆形成
（5）挑克隆，有两种方法，一是用克隆环，二是消化后，直接用枪头，具体可以PM我。
祝好运！
66小飞侠 (2012-9-14 17:13:42)
谢谢大侠！
转染之后的传代有什么意义，不传代直接用G418可以吗？
viviwang1987 (2012-9-14 17:14:01)
传代是为了方便筛选克隆。
nn255 (2012-9-14 17:16:05)
QUOTE:
同意楼上的说法66小飞侠 (2012-9-14 17:16:24)
谢谢大侠们！
我以前是转染后24小时加G418，没有经过传代。可能问题就出在这里。我今天试一下这种方法。
66小飞侠 (2012-9-14 17:18:57)
还有一个幼稚的问题需请教，上述的1：10，1：20等比例是一个dish分到10个dish，20个dish中吗？
谢谢！
KGZ564 (2012-9-14 17:19:19)
1. “转染后24小时，按1：10，1：20，1：40传代到10cm dish，第二天加G418”的意思是转染后48小时才加G418？还是传代之后2--3个小时，细胞贴壁后就马上加G418？
2. 另外，在G418筛选的过程中，是否要传代？以前，我曾经遇到过这种情况：一旦传代了，那么细胞会大量死亡；如果不传代，那么经过G418筛选后剩下很理想的一小堆贴壁的 细胞，一旦把它们消化了再传代后就会死掉。是否老死的？
3 现在我是传也不是不传也不是，您说该怎么办？
KGZ564 (2012-9-14 17:19:35)
另外，我是一直用24孔板的，一次性的，您说我该用DISH吗？你是用多大直径的DISH
TAT (2012-9-14 17:20:49)
（2）传代的目的是为了后续的单克隆化的挑克隆，如果在24-well或6-well里挑克隆，操作很不方便。现在常用的dish是10 cm的，当然6 cm也可以。
至于你说的“经过G418筛选后剩下很理想的一小堆贴壁的 细胞，一旦把它们消化了再传代后就会死掉”这种现象我碰得不多，细胞死的话是因为传之前状态就不是很好，如果状态好，传代到96 well，几天就能长满了。
66小飞侠 (2012-9-14 17:21:19)
我在传代一天后加G418，第二天细胞很多都死了，请教正常吗？
如果不正常，是什么原因呢？
急问！
greenbee (2012-9-14 17:21:38)
不正常，我以600ug/ml 浓度G418筛选，一般应在3天后开始死亡，一周后死光。我以前用3T3做尝试，结果转染过程中细胞死亡严重，而其他细胞效率极高，可能有些细胞对脂质体或DNA敏感性大。可以考虑调整转染参数。
66小飞侠 (2012-9-14 17:22:26)
还有一个问题想问，我的细胞传过好多代了，对筛稳定株有没有影响。
fei1226com (2012-9-14 17:22:46)
在传代后的24h就可以加G418，这个时间及G418开始发挥作用的时间之和足够抗性的细胞生长。关键是细胞状态。在转染前要作G418系列浓度以确定筛选浓度和维持浓度，在转染后24h细胞还比较脆弱，不建议直接用筛选浓度，可先用维持浓度维持2d，第二次换液时再用筛选浓度筛选大概1周作用。具体情况还要看细胞状态。
仅为个人见解，还望高手指正。
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