【求助】想问一下处理细胞做western的问题

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• zranqi_1 (2012-9-15 13:01:23)

  
  我最近也在做细胞的western相关试验。以下是我总结的方法，仅供参考。
  1。如果细胞是半贴壁细胞，用冷的PBS漂洗细胞2次，加PBS用枪头吹下细胞，离心去上清，加入一定体积的裂解液（PMSF临用前现加），再加2*上样 buffer煮沸10min，离心上样；
  2。贴壁细胞，用冷的PBS漂洗细胞2次，加入一定体积的裂解液（PMSF临用前现加，冰上）裂解细胞数分钟，用细胞刮刮下细胞，连同裂解液和细胞碎片共同转移至离心管中，再加2*上样 buffer煮沸10min，离心上样；
  另外，对于贴壁细胞，我也试过用胰酶+EDTA消化下来，再用冷的PBS漂洗细胞，再加裂解液等的方法，SDS-PAGE 及western结果并没有显著影响，总之把握一个总原则，即低温和加蛋白酶抑制剂。
  多多交流！

• 101010 (2012-9-15 13:01:49)

  我也是新手上路，以后多多交流。如果方便的话，能告诉我细胞裂解液的成分吗？
  另外，你一般用什么公司的antibody，我想买cell signaling 的，不知道咋样？

• zranqi_1 (2012-9-15 13:02:45)

  
  直接加裂解液的话，总体积太多了，感觉损失比较大，不知道大家有什么好办法。
  
  我是用胰酶消化后收集细胞，然后裂解（20000个cell/微升裂解液）,提总蛋白。配方是分子克隆第二版的单去污剂法，不加叠氮钠。
  
  50mM Tris-HCl (pH8.0)
  150mM NaCl
  100ug/ml PMSF
  1ug/ml Aprotinin
  1% Triton X-100

• jrwyyplt (2012-9-15 13:03:16)

  
  无论是做Western， 还是做Flow, 我们都是先将Macrophage消化下来，再进行后面的实验。

• DDD (2012-9-15 13:03:56)

  我是用ripa buffer (含protease inhibitor)來digest 細胞, 3.5公分的culture dish用25ul ,6公分及10公分算一下面積就可,incubate 5 分鐘, 將digest 好的cell extract transfer到eppendrof tube , 在冰浴上作超聲波震盪到看不到 cell pellet , 低溫高速離心, 取supernatant , 加到loading dye裡, 95度5分鐘, 把蒸汽spin 下來這樣就可以prepare to used 了

• 101010 (2012-9-15 13:04:24)

  感问各位：Aprotinin起什么作用？

• zranqi_1 (2012-9-15 13:05:15)

  
  Aprotinin和PMSF一样，都是蛋白酶抑制剂。

• BOSS2011 (2012-9-15 13:06:14)

  裂解液配方：
  150 mM NaCl
  50 mM Tris-HCl, pH 7.4
  1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride
  1% Triton X-100
  1% sodium deoxycholic acid
  5 µg/ml of aprotinin
  
  我的一抗是用的BD公司的。

• HP007 (2012-9-15 13:06:36)

  
  我将细胞消化下来后，PBS洗三次，弃液，细胞沉淀直接加2*SDS上样buffer，煮10分钟，做下来还不错，蛋白浓度较高。

• windy+++ (2012-9-15 13:06:59)

  
  对啊，我也是用上样buffer裂解细胞的，效果没问题的。

• qhyu (2012-9-15 13:07:22)

  补充一点：贴壁细胞，其实用你的裂解液配方，在用PBS漂洗细胞三次，充分去除培养基的FCS 的情况下，细胞可自行从培养瓶壁上脱落～
  此法可避免xinglinzi的用胰酶消化，造成目的蛋白的降解，收集产物也较全。
  
  以我的研究为例，15L培养瓶（培养面积 2200Cm2）加入100ml 裂解液,手工转动10Min 以内，贴壁的Vero细胞即可全部脱落。
  
  大家可以试试～
  欢迎交流HaHa ～