【求助】人骨髓间充质干细胞分离及培养技术

最新回复

• fklo83 (2012-10-05 16:33:14)

  培养中倒置显微镜观察：见除极少量梭形细胞贴壁外，还有较多小的点状物贴壁，与细菌大小相似，但仔细观察没有活动，而且数日后未见大量生长。不知这是什么东西？
  
  关于人骨髓间充质干细胞的特性：我培养的第3代细胞均呈长梭型，很长，甚至比成纤维细胞更长。这与羊的骨髓间充质细胞不一样，羊的细胞形态多呈三角形，而且较小。
  不知这对不对？

• milkdog (2012-10-05 16:33:31)

  
  血清中的胶原虫污染。

• fklo83 (2012-10-05 16:33:58)

  血清中的胶原虫是什么东西？
  血清是进口产品，怎么会有这种东西呢？

• milkdog (2012-10-05 16:37:21)

  
  进口的也有！HYCLONE就有这种宝贝东西！你买那家的？

• fklo83 (2012-10-05 16:37:40)

  
  我的血清就是HyClone的，什么是胶原虫呀？

• milkdog (2012-10-05 16:41:44)

  
  就是一种小虫子！厉害的话回让细胞完蛋的！

• fklo83 (2012-10-05 16:42:04)

  0.25um的滤器过滤有效吗?
  如果真如细胞一样大小,应该有效吧?

• fklo83 (2012-10-05 16:44:22)

  
  应该是细菌,对不起

• tuuu2 (2012-10-05 16:44:40)

  
  我认为应用DMEM（低糖）+10%胎牛血清（GBICO） 培养基培养MSC

• fklo83 (2012-10-05 16:44:58)

  我没用低糖DMEM养过。但我们这里很多人都用高糖DMEM+10%胎牛血清养MSCs，养得很好。高糖DMEM与低糖DMEM差别很大吗？
  当然，文献上说的几乎都是低糖DMEM或α-MEM。

• kswl870 (2012-10-05 16:45:23)

  血清中的胶原虫污染。
  
  ————————————————————————————————————————————————————————————————
  
  不是胶原虫（黑焦虫，牛焦虫），首先胶原虫呈指状，在细胞状态良好时增殖迅速，其次胶原虫可以运动，可见旋转或者大范围游走（特别是两三个间头尾相连，游动能力更强，在400倍下可以很清晰看到，较细菌大）有人说国外血清遇到机会较多。听别人讲广西的牛体内有此物，而且牛已获得免疫。不过还是很难说，这东东的来源。可惜没有CCD要不就可以给大家放一段了。
  很难去除，所以只能扔掉，不做这回的应该不是胶原虫
  http://www.dxy.cn/bbs/thread/128981

• fklo83 (2012-10-05 16:46:37)

  这段时间细胞一直在长。而且没有看到那种东西游动或生长。

• daod (2012-10-05 16:47:59)

  培养液中的东西可能是血清解冻过程、灭活过程没有很好缓慢摇匀，GIBCO进口胎牛血清会出现点状物，但不影响细胞生长。

• remenb (2012-10-05 16:48:17)

  
  整个操作过程灭有多大问题，偶认为可能是些细节问题你还没有注意到。
  首先 保证你所用的培养用的器械无菌，无毒，最好是一次性使用的，尤其是培养瓶/板，培养液还是买液体的吧。
  其次 可以看到你整个操作过程还是比较长的，偶以为离心最好是在4度的环境下，有利于保护细胞，收集细胞要完全，尽量将白膜层吸尽。
  再次 血清偶以为不应该是问题，至少偶在使用时从没出过问题，偶认为进口血清不需要灭活的，除非做免疫方面的实验，这些东东的质量还是能信得过的。
  还有 细胞种植数量可以考虑适当放大一点，不要吝惜你得原材料，细胞数量少，很难生长的，首换液时间也可适当延长，如果ph值不是很低的话。增加细胞帖壁时间，是在不行用纤维连接蛋白处理一下培养瓶，试试看。
  DMEM可以成功的，不行的话可以换IMDM加20％的血清试试看。
  
  以上拙见，仅供参考

• remenb (2012-10-05 16:49:12)

  人骨髓10ml，加入PBS10ml，离心：900g、20分钟、20度；然后同样方法再洗一次。900g 900g 900g 过大，细胞是不是死拉！？我用的是200g ，15分钟，很成功，已冷冻了大量细胞。

• remenb (2012-10-05 16:49:39)

  
  界面上乳白色绒毛状细胞层聚集明显。将细胞吸入10mlPBS中，离心收集细胞：900g、20分钟、20度。
  然后用培养基2ml重悬细胞，计数，以2×105/cm2接种到25cm2培养瓶中,观察见细胞数量较多。
  900g、20分钟、20度
  900g、20分钟、20度
  900g、20分钟、20度
  细胞被你离死啦！！！！！应200g，5分钟。

• fklo83 (2012-10-05 16:50:07)

  200g,5分钟？
  200g在我使用的离心机上大概是500rpm，这种速度是不是太低了？
  我所使用的方法是参考文献方法进行的，但的确还没有得到很好的效果。
  希望有高手推荐MSCs分离更好的方法。
  谢谢指教！

• remenb (2012-10-05 16:50:46)

  
  先用400g，5分钟试试吧，应 能行的。

• fklo83 (2012-10-05 16:51:15)

  我会试的。
  还请教一个问题：在三种DMEM中（高糖、低糖、F-12），你选用的是哪一种基础培养基。哪一种最好呢？
  我原先用的是高糖DMEM，结果细胞生长比较慢；现在想用DMEM-F12，你觉得好吗？

• qumm1985 (2012-10-05 16:51:46)

  QUOTE:

  原帖由 fklo83 于 2012-10-5 16:51 发表
  我会试的。
  还请教一个问题：在三种DMEM中（高糖、低糖、F-12），你选用的是哪一种基础培养基。哪一种最好呢？
  我原先用的是高糖DMEM，结果细胞生长比较慢；现在想用DMEM-F12，你觉得好吗？ ...

  我们养神经干细胞一般多用DMEM/F12，效果不错。