【求助】有谁在养新生鼠的心肌细胞啊？

最新回复

• idea2011 (2012-10-05 17:13:40)

  
  我也不很清楚你的实验。
  1.瓶子处理是否干净
  2.可以加细胞外基质的吗？如：鼠尾胶原，明胶，laminin，fibronectin
  3.是否可以加一些细胞因子or激素
  4.玻璃培养瓶是否不如塑料培养板贴壁好，是否使用进口培养瓶或培养板
  5.首次加培养液是否过多
  6.是否用过国外胎牛血清及培养基配方选择
  7.是否可用eeflying主任所说的“用血清铺底 加入血清，静置１０min，倒掉血清，４Ｃ
  放置过夜，让血清干涸，即可用于培养。”

• vera+ (2012-10-05 17:13:58)

  取材时可以取出心室大部分，胰酶浓度不可太低，我的经验0.125%就不错。
  可用多聚左旋赖氨酸处理玻片或培养瓶促黏附。不过，我觉得只要细胞活力高，黏附就不会成问题。

• okhaha (2012-10-05 17:14:52)

  
  请问楼上的先生只用胰酶消化吗？你消化多长时间，请详细介绍一下你的经验好吗？我的心肌细胞总也养不好，我已经万念具灰，快来帮帮忙吧！

• 社会主义好 (2012-10-05 17:16:29)

  
  新生鼠心肌细胞可以不用胶原酶，只用胰酶。
  消化的时候控制在终浓度0.25%比较好，因为这个浓度的胰酶对心肌细胞不会产生太大损伤，而且消化速度比较快，细胞活力比较好。
  消化的时候用稍微长一点的巴氏吸管，不断吹吸，37度。8min一次。
  缓冲液用D-HANK比PBS好。
  心脏多一点比较好。
  祝你成功

• nn255 (2012-10-05 17:16:48)

  新生鼠心肌细胞可以不用胶原酶，只用胰酶。
  消化的时候控制在终浓度0.25%比较好，因为这个浓度的胰酶对心肌细胞不会产生太大损伤，而且消化速度比较快，细胞活力比较好。
  消化的时候用稍微长一点的巴氏吸管，不断吹吸，37度。8min一次。
  缓冲液用D-HANK比PBS好。
  心脏多一点比较好。
  祝你成功
  
  0.25%的胰酶的终浓度是否太高了。本人用0.125％的都有人觉得高，文献上大多是0.1%的。
  消化时可放在离心管内在37度水裕，每次10到15分钟，每隔3分钟反复振摇，取第一次以外的消化上清液。可多消化几次，若组织块逐渐呈絮状，则消化得很充分。
  我觉得PBS比D-hanks要好，因为D-hanks呈红色，影响消化效果的观察。
  祝你好运。

• ladyhuahua (2012-10-05 17:17:31)

  
  试试不同的血清和培养基吧,hyclone,gibico都不错,注意批号,同一家的冬冬,特别是血清,不同批次促细胞生长能力和针对细胞类型也有区别,我的经验.祝你成功.

• fklo83 (2012-10-05 17:18:23)

  
  我正在养乳鼠心肌，但是不知操作哪里不正确，有时污染。
  十分愁人。
  是否试验目的是要研究心肌收缩功能才要用心室肌的？
  心房肌为什么不用与细胞培养？

• dotaaa (2012-10-05 17:19:21)

  
  请看附件

  
  39031513.jpg

• zhenxin (2012-10-05 17:20:38)

  
  我用的胰酶的浓度为0.1%，37℃，每次消化10min。首次消化要去掉。然后消化8-10次。轻轻吹打，静止后吸取上清，1500转离心10min。每次用10只乳鼠。在磁力搅拌器上消化，搅拌速度不要太快。
  相信你会成功

• eric930 (2012-10-05 17:21:05)

  
  用的胰酶的浓度为0.06%，37℃，每次消化10min。首次消化要去掉。然后消化7-9次。轻轻吹打，静止后吸取上清，1000转离心10min。每次用12只乳鼠。在磁力搅拌器上消化，搅拌速度不要太快。切记勤用酒精擦手，各种管口勤过火，手一定不能碰瓶口。

• lagua123 (2012-10-05 17:22:00)

  
  我的经验：
  ⑴乳鼠心肌细胞的制备
  取3-5日龄SD乳鼠，以2％碘伏，75％酒精消毒皮肤。在超净台内，固定乳鼠，胸部向上以2％碘伏，75％酒精消毒胸腹部皮肤，剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，依次用碘伏，酒精消毒皮下组织。更换剪子及镊子，开胸取出心脏，将心脏放入盛有冰DMEM液的平皿中洗涤，(可将平皿放在冰块上，以降低DMEM温度并减慢细胞代谢)。剪去心房，取心室肌放入另一平皿中，用吸管吸取DMEM液，反复冲洗三次，以洗净心室肌组织上残留积血。将心室肌放入大离心管的侧壁上，用剪子将其剪成1mm3大小的碎块以备消化。
  ⑵乳鼠心肌的消化
  加入6-10ml含0.06％胰蛋白酶的消化液，用吸管轻轻吹打60次以上，吹打时以不生成泡沫为好，以免泡沫形成的张力损伤细胞。在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化15分钟后，自然沉淀，弃去上清(上清内主要为红细胞，细胞碎屑及死细胞)。再加入6-10m1含0.06％胰蛋白酶溶液，再用吸管吹打组织块约1分钟后，按上述同样条件及方法，消化10分钟后，自然沉淀，将上清液移入另一无菌离心管中。沉淀的组织块，再加入胰蛋白酶进行消化，并自然沉淀，其上清液如上所述，移入无菌离心管中。其沉淀部分再加入胰蛋白酶进行消化，如此反复消化4-5次，至组织块几乎完全消化为止。
  ⑶终止消化、制备细胞悬液
  在离心管中加入5毫升冷DMEM培养液和小牛血清0.5毫升，以终止消化，离心10分钟(2000转／分)，弃去上清，沉淀中再加入DMEM液5毫升，用吸管吹匀，再将此细胞离心，弃去上清，以充分洗去残存的胰蛋白酶。最后用含10％胎牛血清的培养基，将细胞沉淀混匀，制成细胞悬液。将各次消化所制成的细胞悬液集中混匀，以备接种。

• ROSE李 (2012-10-05 17:22:31)

  正在做乳鼠心肌细胞的培养与功能测试，有几点体会：
  1. 胰酶的浓度和用量不可太大，胰酶对心肌的损伤还是较大的，我现在用0.1%浓度，用量根据鼠心数量而增减，一般15个心脏用10ml。消化过度时，粘滞的DNA明显增多，接种后沉淀也多。
  2. 第1（2）次消化后的上清应丢弃，因为含血细胞及碎片多，而离心后可发现所得的细胞远远少于第4～8次消化所得的上清。
  3. 细胞的搏动与否及快慢，除与细胞活力有关外，还与温度、PH、接种密度、接种天数有关。温度是最明显的，从37度移到常温下，心跳马上越跳越慢，有时甚至停跳，抑或急速颤动，尤其是在最初的3～4天，所以观察心跳最好有37度恒温装置。心肌对PH的变化也很敏感，所以观察是最好能提供5％CO2和95％空气组成的混合气，没有条件的培养基中应加入HEPES以缓冲，我有几次打开瓶盖后不久心肌就不跳了（没用气体也没用HEPES），不过心肌不跳不等于它死了，可当场用台盼蓝染色，或用1～10uM异丙肾上腺素刺激一下（效果很明显）。
  接种密度也是个不容忽视的问题，密度高则心肌细胞易生长而融合成单层，不仅跳动早，而且成片跳动（有时48h时就可成片跳动），频率快；而密度低尤其是呈单细胞状态时，则跳动晚且慢、不规则，或不跳，有时在第4～5天时，成纤维细胞大量增殖后，使不相邻的心肌通过成纤维细胞的电耦合而一起跳动；中等密度的接种，心肌细胞常在第4天聚成簇且被成纤维细胞分割而成簇跳动，各簇的频率可不一样。
  4. 在相差显微镜下，心肌细胞有很强的折光性，而成纤维细胞没有，这是二者早期的一个区别，尤其是在心肌细胞未跳动时，有较好的参考价值。
  5. 乳鼠心肌细胞培养的二大难题始终未得到良好解决，一是乳鼠心肌只能在出生后1～3周内极有限的增殖，不能传代即没有可用的心肌细胞系（这意味着每1～2周就得做一次原代培养，既费力且可能有批见差异），也有的参考书将原代心肌细胞经胰酶消化后的再培养称为“传代”，但这并非真正意义上的传代，也许只有指望干细胞了。二是成纤维细胞的过度增生问题，尽管想了很多方法，如差速贴壁、Brdu、阿糖胞苷、血清和L－谷氨酸剥夺、细胞淘洗等，心肌细胞与成纤维细胞仍然是鲜花和野草的关系，做功能测试最好还是在3～5天之内，否则野草马上春风吹又“盛”。心肌细胞的搏动频率也会随着成纤维细胞的大量增生而越来越慢。
  这是近来的一些心得，请有兴趣的战友们一起讨论。
  另外，我想请教各位战友，在心肌细胞分离，经差速贴壁后，心肌细胞的台盼蓝染色存活率大概是多少，我的一般在60％～70％左右，而国内有的文献报道差速贴壁后存活率仍达90％以上，国外的文献似乎未提到这一点。
  还有，在35mm Petri dish中我采用1×10E6，在24孔和96孔中的接种密度朋友们有经验吗？
  请朋友们帮忙。