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【求助】有关HL60细胞及培养基
各位高手！【求助】有关HL60细胞及培养基
小弟昨天复苏了两管HL60细胞，培养液用的是1640＋胎牛血清（没有加缓冲液）
复苏初，细胞形态还算良好，第二天早上发现细胞大量死亡，
死亡原因断定为培养环境过酸！
因为，复苏用的培养基，只过了四小时就已经变黄，换液后到第二天早上相隔十几个小时！
为什么会变酸那么快？那位高手能介绍一下经验！
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【求助】有关HL60细胞及培养基
【求助】有关HL60细胞及培养基
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-10-07 13:48 作者: vvmmoy 来源: 分析测试百科网
最新回复
我佛慈悲 (2012-10-07 13:48:54)
QUOTE:
我个人认为，如果你的1640同时养过别的细胞是好的，就不太可能是上述原因，否则，另当别论。HL60很好养的。如果是，你培养基中加碳酸氢钠了么？
要排除培养液的污染，可以通过单独培养培养液1～3d来证明。
细胞冻存不好也可能，包括冻存或复苏时有污染。
其它可能的原因还有孵箱CO2控制系统坏了，当然其它细胞都应该会变色。
泛泛而言，供参考。等你有了结论希望说一声。
vvmmoy (2012-10-07 13:49:39)
1640是用来养过其他细胞的，也判断培养基没有问题！
我觉得培养基变黄那么快，不是细胞代谢造成的，可能是细胞死亡，
我想到另外一个原因：就是我在复苏的时候没有将DMSO洗掉，也没有离心。我是直接将冻存管中的液体转移到有培养基的方瓶中。会不会是DMSO的存在对细胞的生长产生影响？
现在还有少量活细胞，希望能救活！
我佛慈悲 (2012-10-07 13:50:15)
QUOTE:
细胞死亡后有很多物质释放出来，因此会导致液体变黄。就像在死人堆里活人也是活不好的，因此现在你也可以通过1300rpm/400g×5MIN离心，去除这些影响细胞的物质，换液后细胞就会好起来。DMSO直接转移到培养基的做法有不少人用，但不是一个好办法，可能是导致你不顺利的主要原因。建议复苏后（快速）放入5～8ml培养基或PBS的培养基中，1300rpm×5MIN洗涤后再加入完全培养基，可以大大降低细胞死亡率。
vvmmoy (2012-10-07 13:50:41)
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因为细胞碎片比较轻，离心可以将细胞碎片除去是吧？ 但是现在活细胞的数量还是比较少，按照你所说的方法现在离心的话会不会对细胞有比较大的损伤？？
另外，通过分瓶，放在恒温培养箱和CO2培养箱比较过后，发现培养液快速变化的主要原因是CO2的影响。培养基在CO2培养箱中几个小时就会一定程度的变酸，再放回恒温培养箱后有会一定程度的恢复到碱性环境。一直放在恒温培养箱的，培养基就不出现快速变酸的现象了。
阿k (2012-10-07 13:51:20)
我觉得培养基变黄那么快，不是细胞代谢造成的，可能是细胞死亡，
我想到另外一个原因：就是我在复苏的时候没有将DMSO洗掉，也没有离心。我是直接将冻存管中的液体转移到有培养基的方瓶中。会不会是DMSO的存在对细胞的生长产生影响？
现在还有少量活细胞，希望能救活！
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我一直在养HL-60,是很好养的细胞.
复苏时不能直接将冰冻管中的液体转移到培养方瓶.需要通过离心洗掉DMSO,然后移到方瓶,24h后换液并计数一次,然后观察复活的情况再传代培养.
我曾经也碰过细胞复活24h后培养液变酸,细胞变小,荧光显微镜下颜色发暗,这是细胞趋向死亡的信号.
我的经验是:离心换液观察.此时还活着的细胞生长虽然缓慢,但是已死亡的细胞分泌物会影响培养液,所以最好每天在显微镜下观察,根据情况48-72h换液一次.大概一周左右就应该没有什么问题了.
vvmmoy (2012-10-07 13:51:56)
QUOTE:
非常感谢！现在已经一周了，但是细胞还是没有完全活过来，其中两瓶中的细胞有长好的趋势！
我曾经离心过一瓶，但是因为细胞数量太少，离心操作过程丢失了不少，换瓶后只能见到几个比较健康的细胞。
阿k (2012-10-07 13:53:17)
QUOTE:
没关系.我那时也是这样的,一离心后看见就只有几个健康的细胞,不过我没有放弃,还是耐心的继续观察换液,最终还是复活了.
到健康细胞有三分之一时你就可以试着传代一次,这是用一半的量传代,然后在看情况.这样传代后刚开始生长还是比较慢的,两三次后细胞基本上活了之后你会嫌它长得太快的,呵呵
加油呀!
vvmmoy (2012-10-07 13:53:59)
^_^
有一瓶细胞，一团一团的。
哈哈，过两天应该就可以传代咯！
huifeng0516 (2012-10-07 13:54:58)
QUOTE:
有一个问题，您说的一团一团的是夸张的说法还是真的一团一团的？我养HL-60就算细胞状态很好，生长很快的时候也没有一团一团的，细胞
都是分散的。
qqq111 (2012-10-07 13:56:07)
1640里添加丙酮酸钠，110mg/L, 巯基乙醇20uM, 谷胱甘肽50mg/ml, 转铁蛋白20ug/ml，胰岛素10ug/ml,胆固醇7.8ug/ml, 添加hyclone 血清7.5%即可。
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