【求助】求教静脉内皮细胞培养经验

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• abc816 (2012-10-07 19:13:44)

  我读硕士的时候作过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养，有些体会和你分享一下吧。
  在产房取得新鲜脐带，HUVEC的分离方法参照Jaffe等的酶消化法并稍加改进。取大约25cm长，PBS冲洗去掉残留血液，脐带断面可见较宽的两根脐静脉以及较细的一根脐动脉，只冲静脉即可；然后夹闭一端，从另一端向静脉内灌注37度预温的0.25%胰蛋白酶致血管充盈，夹闭灌注端，37度水浴消化20分钟，然后放出消化液，用含有10%小牛血清或胎牛血清的RPMI1640培基（为防污染要记得加抗生素）冲洗血管一次并起到中止消化的作用，4C x 1000rpm x 10min离心，收集细胞进行培养，培养使用完全培养基，一定记得加VEGF，否则细胞长得不好容易死。内皮鉴定：镜下观察呈铺路石样，VIII因子免疫组化阳性。
  有问题再切磋！

• baidukk (2012-10-07 19:14:10)

  你好，我也是培养人脐静脉内皮细胞，已分离四次，但是全部失败．现在找不出原因．能否请教你呢？我用的是1640培养基．我们教研室老师说他们都不加碳酸氢钠，细胞也长得很好，但是我没有加碳酸氢钠之后培养液不一会儿就变酸了．我考虑是不是因为培养液的问题．还是有污染呢？能否告知你们配培养液的具体方法呢？下面附我的配方请你多指教，我配了两次：
  1）1640粉剂加双蒸水至700毫升，再加入青霉素和链霉素各100万单位，配至1000毫升．除菌之后加入20％小牛血清．其ＰＨ值为7.25．
  2）1640粉剂，加1.75碳酸氢钠，加4.5克HEPES，加双抗配至1000毫升，除菌之后加入20％小牛血清．但是其ＰＨ为6.67，是不是HEPES加多了呢？
  我还想问你们配培养液的时候，水，容量瓶全部高压吗？

• dragonkilly (2012-10-07 19:14:50)

  
  水和容量瓶配制时无须灭菌的，你加的抗生素浓度是不是太高了。我们1000ml只加10万单位呀！！而且我们培养用的是10%FCS的M199培养液，挺好的呀！你为什么用1640，没有见过报道。当然有条件的话加VEGF和培养前瓶子用凝胶包被更好！！

• summerxx (2012-10-07 19:15:09)

  
  培养HUVEC的条件和其它细胞是差不多的，培养瓶，配基，抗生素，血清，参看鄂征的组织与细胞培养技术即可。你的抗生素浓度是否高了些？如果加了HEPES缓冲能力应该可以了。有条件加些VEGF细胞会长的很好。

• bongte (2012-10-07 19:15:42)

  不知道内皮细胞融合需要多长时间，我已经花了很长时间，还是那么小，那么少！
  我在培养基里加了1ng/ml bFGF ,量足够吗？
  是否一定要加其他的 比如肝素、HEPES