【求助】请求原代培养指导

最新回复

• summerxx (2012-10-08 14:46:41)

  
  收集100目网上物1000rpm离心5min？
  为什么取网上物？
  你的消化过程放在哪一步前面？是100目滤网过滤后，还是组织剪碎后（80目过滤之前？）

• xevin (2012-10-08 14:47:10)

  
  谢谢楼上群友！
  具体步骤如下：
  1. 大鼠实验前12小时禁食，自由进水。
  2. 处死后无菌取肾，置于PBS的培养皿中(25℃)，分离、剪碎肾质 （约 2mm大小）。
  3. 置于80目不锈钢网筛，研磨并以PBS充分冲洗。
  4. 网下液体倒至100目不锈钢网筛上，收集网上物于装有生理盐水的培养皿 中。
  5. 充分吹吸后，1000转/分钟，离心5分钟。
  6. 离心后弃上清液，加入0.2%胰蛋白酶1.5～2.0ml，充分吹打使之混匀消化液与离心物。置于37℃振动水浴中，消化20分钟，1500转/分钟×5分钟.  
  小心弃上清后加入5ml含有10%新生小牛血清的RPMI1640培养液，充分吹打混匀后装入培养瓶中。
  7.置孵育箱(37℃、5%CO2)培养，第3天更换培养液。
  
  第二次取细胞时，消化后我没有离心而是用培养液终止消化，再置于孵育箱中培养，因为听人说离心可以损失30%的细胞。
  
  请赐教！

• xevin (2012-10-08 14:48:20)

  
  我还有问题请教
  
  肾小管上皮细胞不能耐受缺血，应尽量减少操作时间，所以我想在0.2%的胰蛋白酶消化上省点时间，或者根本不用消化，不知可行否？另外我不知道胰蛋白酶消化有什么作用？不应该是使上皮细胞从肾小管上脱落下来吧？因为据文献知消化后，依旧主要是肾小管节段贴壁。
  
  谢谢指点！

• 火树银花nm (2012-10-08 14:48:56)

  
  我做过心肌细胞的分离，
  组织剪碎后，PBS冲洗一下，弃上清。胰酶消化成悬液以后，再过筛网。然后离心。没有经过碾磨等步骤。胰酶充分消化就足够了，组织快最好剪成1mm3大小。

• xevin (2012-10-08 14:49:41)

  
  谢谢楼上回应！
  
  我想肾小管上皮细胞的分离和提取同心肌细胞得分离不一样，明天我准备作第三次提取，拟采用三种形式（1）不用胰蛋白酶消化。（2）消化10分钟。（3）消化20分钟
  
  祝我好运！

• xevin (2012-10-08 15:02:57)

  今天下午刚按上述想法做了第三次实验，倒置显微镜下观察，不用胰蛋白酶消化的瓶内可看见较多的亮的条带，我是新手，请各位前辈教教，条带可能是什么。用0.2%胰蛋白酶消化10分钟和消化20分钟瓶内有许多悬浮的小颗粒，应该是细胞吧？还有三种瓶内都有灰褐色象棉花球样的东西，我不知是什么。
  
  请大师们点拨！

• xevin (2012-10-08 15:06:53)

  告诉各位大虾一见喜事，第三次实验我已成功了一半，因为上述三种方法匀有细胞生长，现在已基本上长满了瓶底，近两天我还准备做细胞鉴定呢

• xevin (2012-10-08 15:07:11)

  这几天我们培养室由于添了一台新的培养相，环境破坏，加上旧的co2调节不稳，细胞长得很慢，可能也有细胞呈片状、复层生长，导致生长抑制。欣慰的是我的细胞一直没有污染。可惜我们的倒置显微镜的相机坏了，不然传上几张图片，让大家指点指点！

• ero11 (2012-10-08 15:07:37)

  可惜以前没看到你的贴子，我也是和你差不多同时做肾小管上皮细胞培养的。不过我做的是Wistar大鼠，区别不大。方法和你的一样。但我一开始就看到了肾小管节段。原代生长也还可以。比文献上记载的周期要长。但现在传代很成问题，基本上只能到第三代。传到第四代就死光光了。
  不知你现在养细胞养得如何了，传代行不行。
  有空一起切磋一下吧。
  我也拍了不少照片，都挺漂亮的。可惜我没法上传。