【求助】小鼠微血管内皮细胞？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-10-11 16:51 作者: vcve 来源: 分析测试百科网

我培养的是小鼠微血管内皮细胞，有以下问题想请教：
1．用胰蛋白酶和胶原酶消化时是同时加入还是间隔一段时间分别加入？如果间隔一段时间分别加入，间隔时间为多少？如果同时加入，消化多少时间？
2．胰蛋白酶可以被血清中止，胶原酶可以被血清中止吗？如不能中止，用什么方法可中止？
3．血清浓度对细胞有太大影响吗？超过20％是不是更好？
4．国内文献可信度究竟有多高？请教一内行人士说纯粹胡扯（也太偏激了），建议我一定要参考国外文献。
5．培养内皮细胞文献为什么要求5～7天的胎鼠，刚出生的不是更好？
6．用组织块培养时，各种细胞贴壁的时间及次序是什么？如内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血细胞等。
7．既然说组织块培养法又简单又有效，为什么文献还是多采用又复杂干扰因素又多的酶消化法？
8．究竟需要明胶包被培养瓶以利贴壁吗？请详细解释一下如何明胶包被。
9．酶消化法培养时，要求37度震摇消化，是不是放在培养箱中亦可？需要过滤吗？内皮细胞多少目的滤网？过滤后需要离心吗？转数多少为好？

初次培养，十足菜鸟，请高手能否系统回答？多谢！！

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【求助】小鼠微血管内皮细胞？

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rxcc33 (2012-10-11 16:52:10)

我知道点点,说一下:
1 血清浓度对细胞有太大影响吗？是不是更好:
我看你是作原代培养,血清浓度高点好,最好是胎牛血清,能超过20％,我曾用过30%.但不是小鼠微血管内皮细胞.
2 国内文献可信度究竟有多高？
最好不要信.
3 既然说组织块培养法又简单又有效，为什么文献还是多采用又复杂干扰因素又多的酶消化法？
酶消化法比组织块培养法快,但复杂,代价高些,如胶原酶很贵.
4 培养内皮细胞文献为什么要求5～7天的胎鼠，刚出生的不是更好？
胎鼠越小,细胞越好长,是这样的.
5 究竟需要明胶包被培养瓶以利贴壁吗？
包被一下好些.具体可查资料.有时不包细胞不贴壁.
你作过以后就知道了,外人说的不一定对,细胞培养要自己体会的.
yueban-1147 (2012-10-11 16:52:33)

通常做血管内皮细胞培养都是用的比较大型的动物或用比较大的血管，要用酶消化法获取新生小鼠微血管内皮细胞，操作起来会很难，

哪位做过的高手能具体指点一下吗？

thanks a million!!!
IAM007 (2012-10-11 16:53:09)

我培养的是小鼠微血管内皮细胞，有以下问题想请教：
1．用胰蛋白酶和胶原酶消化时是同时加入还是间隔一段时间分别加入？如果间隔一段时间分别加入，间隔时间为多少？如果同时加入，消化多少时间？
你养的是什么微血管内皮？
1．其实单用一种酶消化就可以了，建议用胶原酶，温和一些。
2．胰蛋白酶可以被血清中止，胶原酶不可以被血清中止。EDTA可中止，但不适合你的实验。
3．血清浓度对细胞有很大影响，据说低于20％血清不长，建议使用Hyclone的胎牛血清，效果很好。
4．有的国内文献还是很可信。
5．培养内皮细胞文献不一定非得用5～7天的胎鼠，我做的就用100克左右的大鼠。
6．用组织块培养时，各种细胞贴壁的时间及次序是什么？如内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血细胞等。
7．组织块培养法和酶消化法各有优缺点，根据不同实验采用。前者慢，而且条件不好摸，并且有较多杂细胞，需要纯化，而且成纤维细胞很容易先爬出来；后者可以通过胶原酶杀死成纤维细胞，而且快速，不过价钱贵一些。
8．用明胶包被培养瓶(塑料瓶)后培养细胞有利贴壁，有利于细胞迁移，不同的细胞外基质对细胞的影响不同，有的可以抑制细胞迁移的。用0.5%明胶PBS包被瓶子，放置温箱中孵育1小时，取出用PBS冲洗1遍，用含有10％左右的新生牛血清的培养也冲洗1遍，即可使用，玻璃瓶一定要包被。
9．最好别振荡，因为速度快了会消化过度。需要过滤，微血管内皮细胞可以用200目的滤网不用离心。
10、培养该细胞的最关键的问题是让细胞快长，因此足够的生长因子浓度是很有必要的，细胞长快了，自然杂质细胞就少了。
greenbee (2012-10-11 16:53:38)

QUOTE:
原帖由 IAM007 于 2012-10-11 16:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我培养的是小鼠微血管内皮细胞，有以下问题想请教：
1．用胰蛋白酶和胶原酶消化时是同时加入还是间隔一段时间分别加入？如果间隔一段时间分别加入，间隔时间为多少？如果同时加入，消化多少时间？
你养的是什么微血管内皮？
1．其实单用 ...
国内文章在培养细胞方面写的步骤、方法比较可靠，我做过细胞培养，参考国内文献，成功。我认为将国内文献一帮子打死不可取。
yueban-1147 (2012-10-11 16:54:01)

先谢谢各位战友的热情相助。一时疏忽，把最重要的给忘了。我养的是小鼠（基因敲除小鼠）心肌微血管内皮细胞。
再请问，1。如果没有内皮细胞生长因子，有其他的可代替吗？
2。取下的心肌是用HANKS液冲洗还是D-HANKS液冲洗？二者除了钙镁应该没什么区别吧，有的文献介绍先用HANKS液冲洗再用D-HANKS液冲洗，其中蕴涵什么道理？
3.组织块培养时，细胞贴壁速度是不是先内皮细胞、血细胞--成纤维细胞--其他细胞？
whitesheep (2012-10-11 16:54:35)

我刚好养过大鼠的心肌微血管内皮细胞，用的是出生后4天的大鼠。还是应该用酶消化法做的，不过需要纯化一下，差速贴壁法可以使用。我知道你参考的那篇文献，用的是胶原酶和胰蛋白酶混合使用。
可以使用 ECGF或VEGF，不能用别的代替，碱性成纤维生长因子应该也可以，不过只有更贵。
取下的心肌是用HANKS液冲洗即可。二者除了钙镁没什么区别。文献介绍先用HANKS液冲洗再用D-HANKS液冲洗，其中可能是低钙浓度时，心机细胞更不容易贴壁吧。
组织块培养时，细胞贴壁速度没有考究过，不过内皮细胞和成纤维细胞可能贴壁时间会差不多的，其实二者来源是很接近的。
KGZ564 (2012-10-11 16:55:22)

你所指的那篇文献能提供给我吗？谢谢！

我做的是大鼠肺微血管内皮细胞培养，打算用酶消化法，20μm和60μm滤网，这样收集下来的细胞量会不会太少啊？有没有这个必要呢？
whitesheep (2012-10-11 16:58:15)

我说的那篇文献是心脏微血管内皮细胞的。可能不太适合你的细胞，可能我几个月后会做做你做的大鼠肺微血管内皮细胞培养，前几天看到一本2000年左右出版的书上面有几种方法培养原代大鼠肺微血管内皮细胞，贴块法和消化法都有，好象是《急性呼吸系统疾病临床与实验研究》具体书名我忘了，回头找到了再告诉你。
kulee (2012-10-11 17:02:05)

请教各位高手！
1 如何处理内皮细胞培养时混杂的成纤维细胞及平滑肌细胞等细胞？
2 有没有对内皮细胞影响较小的成纤维细胞抑制因子或其他什么试剂？
3 本人尝试用5%FBS+15马血清代替20%FBS除未能有效抑制成纤维细胞生长外对内皮细胞的生长也不利，原代培养第5天时发现贴壁的内皮细胞已漂浮起来，而成纤维细胞则到处疯长（培养第四天时观察细胞基本正常）？
4 ECGS（endothelial cell growth supplement）配成200ug/ml的浓度保存于—20℃已有5-6个月，是否已经失效？（SIGMA的说明书推荐应配成3mg/ml分装保存于—20℃）我使用的剂量为20ug/ml培养液。是否需要加用50ug/ml培养液的肝素以利于ECGS起作用？
多谢指教！
dog002 (2012-10-11 17:34:31)

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