【求助】大鼠的嗅鞘细胞如何分离，纯化

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• cj_mondy (2012-10-15 15:52:50)

  作CNS损伤修复的？？

• cj_mondy (2012-10-15 15:53:17)

  
  我们这里的方法：：
  
  1.材料和试剂
  
  成年（2－5月左右）SD大鼠，
  DF12培养基，
  胎牛血清（FCS），
  Forskolin,
  牛垂体提取液(BPE),
  阿糖胞苷（Ara-C）,
  胰蛋白酶，
  胰蛋白酶终止剂，
  EDTA，
  DMSO，
  MTT，
  Poly-L-lysine，
  D1-SGH（D1为无钙镁离子的Pucks液,SGH为蔗糖,葡萄糖和HEPES的缓冲液） ，
  P75 抗体，
  25cm2塑料培养瓶
  
  2. OECS 培养
  
  在无菌的条件下，分离2.5月的雄性SD大鼠的嗅球，弃除软脑膜，分离嗅神经层及嗅球颗粒层，用D1-SGH清洗2次,然后用0.125%的胰蛋白酶消化,于37°C培养箱，作用25min，接着用胰蛋白酶终止剂作用8 min.于800rpm离心5min.再加入无血清的DF12培养基清洗一次。最后用含20%的FCS的DF12培养基将其制成单细胞悬液，以1×106/ml的密度接种在经 Poly-L-lysine处理过的25cm2塑料培养瓶中，于37°C，5%的二氧化碳培养箱中进行培养，培养3天后进行半量换液，再培养2天用10%FCS的培养基进行换液。1-2天后进行纯化。
  
  3. OECS的纯化：
  
  在培养好的细胞中先加入Ara-C，其作用浓度为10-5 mol/L,作用36-48hrs后，换上 新鲜的培养基，继续培养1天，弃去培养基，用无钙镁离子的Hanks液清洗2次，然后用0.125%的胰酶+0.02%EDTA消化3-5min,消化时,在倒置相差显微镜下观察,待细胞突起回缩,胞体变圆,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%.作用5min后,用火焰抛光的弯头滴管轻轻吹打瓶壁,细胞悬液于800rpm离心5min, 弃上清,用条件培养液(10%FCS+20μmol/L Forskolin+20μg/ml的BPE+ DF12)制成单细胞悬液，接种培养瓶中，37°C，5%的二氧化碳培养箱中继续培养，30 min后，将培养上清连同未贴壁细胞进行转种。再过30 min重复上一步骤。

• cj_mondy (2012-10-15 15:54:14)

  
  嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cell, OEC）近几年来成为神经生物科学研究的热点，原因是OECs具有促进损伤轴突再生的特性， Amudena Ramon-Cueto等人将OEC悬液注射到成年大鼠损伤的脊髓中, 而促进了损伤轴突的再生和大鼠下肢运动功能的恢复, 这进一步证明了OECs在中枢神经系统损伤中的作用。
  
  但是嗅鞘细胞是否就真的有如此神奇的效果吗？让我们继续关注！！

• wood533 (2012-10-15 15:54:47)

  
  谢谢
  
  BPE 有的买吗？ 还是自己做，好像牛垂体不好找
  另外D1-SGH 具体怎么配啊

• cj_mondy (2012-10-15 15:55:14)

  QUOTE:

  原帖由 wood533 于 2012-10-15 15:54 发表
  
  谢谢
  
  BPE 有的买吗？ 还是自己做，好像牛垂体不好找
  另外D1-SGH 具体怎么配啊

  BPE有买的，你可以查一查！
  
  D1-SGH 可以用其他液体替换，和别的解剖用液一样！

• toy (2012-10-15 15:56:41)

  您好，继续咨询几个问题，谢谢！
  DF12培养基，就是DMEM/F12吗？
  Forskolin,是什么成分，作用？
  有专门的胰蛋白酶终止剂吗？我们培养其他细胞用含血清的培养基终止消化呀？
  牛垂体提取液(BPE),
  阿糖胞苷（Ara-C）,
  D1-SGH
  P75 抗体
  上述试剂在哪能买到？
  非常感谢！

• yueban-1147 (2012-10-15 15:57:06)

  cj，向你请教，你们那里有做脊髓损伤的吗？可以介绍一下损伤模型的制作吗？还有，将OECs或者其他药物（如合成药物）打到损伤大鼠损伤的脊髓中，会不会有免疫反应？如果是在损伤处给药，你们都用过那些方法？非常感谢！！

• cj_mondy (2012-10-15 15:58:01)

  QUOTE:

  原帖由 yueban-1147 于 2012-10-15 15:57 发表
  cj，向你请教，你们那里有做脊髓损伤的吗？可以介绍一下损伤模型的制作吗？还有，将OECs或者其他药物（如合成药物）打到损伤大鼠损伤的脊髓中，会不会有免疫反应？如果是在损伤处给药，你们都用过那些方法？非常感谢！！ ...

  我做过大鼠脊髓损伤模型，包括打击伤、压迫伤、横断伤，异体细胞移植最好需要免疫抑制，药物治疗一般全身给药，除非利用缓释技术可以局部给药

• yueban-1147 (2012-10-15 16:00:23)

  谢谢你。请问你做的横断伤是全横断还是半横断？具体操作？术后护理怎样进行的？因为我是一名新手，也没有看见别人做过，全凭想象，非常想得到师兄师姐们的指导。麻烦你了！

• cj_mondy (2012-10-15 16:03:17)

  全横断、半横断都做过，其实也很简单，背中段正中切口，切除T9棘突椎板，暴露脊髓硬膜，用11号刀片在T9椎板水平半切或全切断脊髓。术后每天早晚两次膀胱挤压排尿，直至建立反射性膀胱排空。