【求助】MTT

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• greenbee (2012-10-25 13:22:01)

  MTT法测细胞相对数和相对活力
  活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
  l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。
  2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。
  3、37℃下保温2小时。
  4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。
  5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。
  
  注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
  附：1、0.4%台盼兰染液配制:台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。
  2、MTT配制：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。
  3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。

• 小糖块 (2012-10-25 13:22:35)

  QUOTE:

  原帖由 wood533 于 2012-10-25 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  哪位有MTT法的资料，请EMAIL给我，zhf1976999@126.com
  感谢！

  你用什么细胞，做MTT目的是什么？请说详细些，我这里有许多刚查到的有关MTT的文章，很多，不知你要哪方面的。

• langlang (2012-10-25 13:23:36)

  
  有关于中药对成骨细胞影响方面的做MTT实验的吗？

• dotaaa (2012-10-25 13:24:14)

  
  有关于中药对成骨细胞影响方面的做MTT实验的吗？

• abc816 (2012-10-25 13:24:53)

  
  你好，我看到期刊上MTT测定MC53细胞的增殖，具体应该怎么做？谢谢

• 911 (2012-10-25 13:25:30)

  
  最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是490nm，但我的经验灵敏度降低一半。
  
  在做MTT，一般大于600nm的波长是用来做参比的，也就是用来做去除非特异性吸光。

• 911 (2012-10-25 13:25:53)

  
  MTT is the method to test the cells in vitro toxicity,
  i have some introduction about it, if u need i can put it on this board.

• fklo83 (2012-10-25 13:26:45)

  
  请教一下，参比波长如何确定？还是固定的630nm?

• redbutterfly (2012-10-25 13:27:18)

  请教一下,我做MTT设了三组,一个是细胞组,第二个是光加培养基组,另一个是空白孔,得出的结果也就有三组.但是我不知道最终结果应该怎么算,是细胞组减去培养基组还是减去空白组,或者两组都要减去.

• 66小飞侠 (2012-10-25 13:28:00)

  
  应用MTT法检测细胞增殖：噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。具体方法如下：1）将MTT以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C。
  2）将材料，置于24孔板。
  3）接种细胞，密度为104/孔，细胞培养。
  4）向待测的每孔细胞加入20ul的MTT液。
  5）继续培养4小时，终止培养。
  6）吸除培养液，每孔加入150ul的DMSO。
  7）酶标仪490nm测光吸收值（OD值）。

• windy+++ (2012-10-25 13:28:46)

  
  各位师兄师姐:
  　　最近我做MTT比色测细胞活性试验遇到了些问题,在HepG2细胞转到９６孔板后，在各个组中加入样品后，培养８～９个小时，再加入２０ulＭＴＴ溶液（５mg/ml)，孵育４个小时后，吸净每孔中的液体，加入１５０ulＤＭＳＯ溶液，在４９０nm波长下测定ＯＤ值，但是在每组样品浓度下的８个样本内，测得的８个ＯＤ值偏差很大，比如说一个是０．５４２，另外一个是０．２１３，另外几个也不是特别的接近．请问这是什么原因，会不是我的细胞老化了（我做细胞传代时觉得细胞有些老化），还有每个孔的细胞绝对数量不太一致，是不是也有关，如果要保证每个孔的细胞数量比较一致，怎样操作才能保证到这一点，另外在加入ＤＭＳＯ这一步后，必须在多长时间内测定ＯＤ值时才有效，是不是有一个时间范围，超过了这个范围就会影响测定的结果．我现在很着急，因为这关系我后面的实验是否可以继续下去的前提！在这里我先向各位师兄师姐谢谢了！

• shenkunjie (2012-10-25 13:29:22)

  
  复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑：
  1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000－10000个。可以细胞细胞计数后，加如细胞悬液，再补培养基道200ul，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加如200ul细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。
  2.贴壁时间：18－24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。
  3.给药：轻轻吸去旧培养基，加无血清培养基，再加等体积样品。注意，样品应先配好再分到各孔中，例如每孔20ul，浓度为10ug/ml，那就该配好160ul的样品，每孔加20ul，加入后，在轻轻吹打混匀。
  4：加MTT，吸去20ul上清，加20ulMTT，轻轻吹打混匀。
  5：4h后，洗掉上清，尽量洗干净，加150ul DMSO，震荡10min，这一步动作要快些，放的越久，颜色越深。振荡过程中用酒精棉球擦干净盖子上操作时可能留的污渍。
  6.490nm测OD值。
  
  我是这样做的，结果不错，复孔之间差别非常小！对了，你的药物是不是有颜色的，这个对MTT也有影响的。细胞衰老，那生长状况会发生改变呀，你可以找个较年轻的HepG2对比一下形状，贴壁时间等等，总之做之前应使细胞状态稳定呀：）

• BUK (2012-10-25 13:29:48)

  请问测MTT时，若我所用的酶标仪没有570nm波长，只有650nm,490nm,450nm,405nm,595nm,可以用其他波长代替吗？急需赐教，谢谢！
  
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  用DMSO替代酸化异丙醇，即可在490nm处测定吸光度值

• ALALA (2012-10-25 13:30:16)

  5：4h后，洗掉上清，尽量洗干净
  
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  请问：您用什么洗的？不洗可以么？还有您种细胞时用的时八道移液器还是单道的？种后混轻轻混匀用什么混？还有您的96孔板是重复使用的么？重复使用对结果影响大么？呵呵，这么多问题。谢谢！

• kswl870 (2012-10-25 13:30:55)

  
  我们用的MTT法,步骤多,容易引入误差.我们组一研究生在网上找到CCK8法,生成的是可溶性的化合武(橙黄色),方法很简单,结果稳定.可以一试.该法的缺点是比MTT贵好多.但实验保证一定的成功率,算起来也不一定费钱.