【求助】请不吝赐教PC12细胞的培养.

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• BUK (2012-10-27 14:45:27)

  5％CO2，DMEM+10%FBS+5%HS培养基，保种用5％DMSO
  该细胞很难大量繁殖，很易成团生长，成团后就开始分化

• jrwyyplt (2012-10-27 14:45:54)

  
  谢谢l，培养PC12细胞的培养瓶需要铺胶原吗？该细胞可以接种动物吗？请各位朋友谈谈培养PC12细胞的经验。谢谢。

• toy (2012-10-27 14:47:11)

  相关疾病：
  肿瘤
  我也是刚刚开始培养这个细胞，一直也养的不是很好，但是却在园子里学到了很多的东西，下面是我从园子中的一些有经验的高手们中摘录的，不知道能不能帮到你，我现在的培养条件5％CO2，1640+10%FBS+5%HS培养基，另外如果一开始养不起来可以先用一次性培养瓶养，然后再慢慢转到玻璃瓶中。
  
  由于我也是用PC12细胞作实验，在实验中碰到的一些问题供大家借鉴：
  1. PC12细胞有两种：未分化型和分化型。
  其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强，传代时需要胰酶消化，形状不规则。
  分化型PC12细胞传代时不需要胰酶，直接可以吹下来，形状规则。
  这两种细胞没有很大的区别，但我在实验中发现，未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。
  2. 由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，在传代次数较多后，它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。
  主要是细胞形状变得更加不规则，对药物的敏感性愈加下降。
  因此，建议长期用PC12细胞作实验的战友最好严格控制细胞的传代次数。
  
  
  在复苏细胞时动作一定要迅速，放入温水中1～2min后要马上加入培养液中，培养12～24小时后更换一次培养液，这样不仅可以把DMSO吸掉，而且可以将死亡的细胞也吸掉。
  细胞一天一看即可，经常动会有影响。
  注意过滤后血清的PH值，因为培养液过滤后PH值会有所改变。
  细胞生长不好，我认为有以下原因：1.有的细胞很脆弱，所以吹打时不要太用力；2.有的细胞对谷氨酰氨的依赖性较强，可考虑换新鲜的谷氨酰氨
  你用的营养液，血清浓度不知道是不是太高。血清浓度高的情况下，细胞容易老化，比较难长满，也难消化。建议降低血清浓度，我想8%-10%应该可以。
  偶不是主任，不过PC12是养过，也长的蛮好，把偶的经验供您参考，希望对您有帮助。
  1. 复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些）

• toy (2012-10-27 14:47:29)

  2. 状态良好的细胞复苏后 4 h即可贴壁，开始增殖，大约2 d即可传代。
  3. 每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。
  4. 传代时我认为最好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS）
  5. 传代的时机最好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时最好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，最后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。
  6. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。
  7. 就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。
  您好，感谢您的帮助。
  
  还想跟您请教一些问题。您用的FBS是国产的还是进口的，您认为国产的
  
  四季清可不可以用。您也不用HS吗？还有，洗涤离心除去胰蛋白酶是多少转多
  
  少分呢？几次？我的细胞传代后老是不长是否就是因为有胰蛋白酶没有终止干
  
  净呢？
  
  我用PC12测试药物，用MTT的方法。96孔板，每孔100微升，100000个/
  
  ml的浓度。接种后24h给药，再过24h后是否就应该到了对数增长期了？
  PC12是生存能力比较强的一种细胞株，用国产or进口的血清，加不加HS均可（这几种我都用过），不过HS更适于神经元的生长，FBS较利于增殖。另外据我所知，国产血清多为小牛血清or新生牛血清，并非真正的胎牛血清。不论使用那一种血清，提醒您注意一下是否已灭活。
  
  去除胰蛋白酶时最好用含血清的培养液在4℃下离心，血清不仅可以中止胰蛋白酶的作用，对细胞也有保护作用，一般用800～1000rpm转10min即可，最好离心洗涤3次。传代后不长有可能与胰蛋白酶有关。
  

• toy (2012-10-27 14:47:54)

  生长状态良好的PC12，接种48h应该到了对数增长期。
  
  由于神经元细胞需要极高的营养条件
  一般需要处理培养皿和培养瓶
  处理方法如下：
  蒸馏水溶解聚L-赖氨酸（10mg/l），过滤除菌，培养瓶内加入溶液，覆盖底壁即可；静置15分钟；去除溶液；加入培养液覆盖底壁，孵育2h，即可接种细胞！按照您的配方，您用的浓度应该是0.01mg/ml，比我刚才看的Midas主任推荐的0.02mg/ml还要低，我们实验室用的浓度是0.1mg/ml．而且我们使用时一般是要包被过夜的，我曾经着急用，就包被了两个小时，好像一点作用都没有．请问一下您用的是Poly-l-lysine还是Poly-D-lysine，我们用的是Poly-D-lysine. 是Poly-l-lysine
  可以适当提高浓度
  或者加入胶原 提高贴壁率

• 彼岸花opp (2012-10-27 14:48:34)

  PC12细胞的高分化型很好养，一般的条件即可，不需HS，培养器皿也不需铺胶。
  低分化型很难培养，我用5％HS＋10％FBS，在不铺胶的情况下，生长极其缓慢，传代后，生长状况更差，细胞死亡增加，细胞数逐渐减少。
  大家所谈的PC12细胞是高分化的还是低分化的，这两种细胞的培养截然不同，请大家多谈一点低分化PC12细胞。
  前文看到，有网友采用MTT的方法用PC12测试药物，可否赐教，用的PC12细胞是何种分型？具体方法？

• ladyhuahua (2012-10-27 14:48:57)

  我现在培养的是未分化的，所以也是比较难养，但是我发现自从我换了血清以后就好很多了，增殖比较快了，不用铺pll也可以长了，我以前是用小牛血清养的。你要是一直都长不好，我还是建议你先用一下一次性的培养瓶试试，然后再往玻璃瓶中转，另外在细胞传代的时候密度不能过小，否则很难长起来的。

• 彼岸花opp (2012-10-27 14:50:52)

  谢谢你的建议，我试一试。
  用高分化PC12细胞可否进行某些生长因子的检测，如上皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）等？有适合的方法吗？