【求助】请教如何分离单核细胞？

最新回复

• 园丁## (2012-11-02 10:57:50)

  
  看起来不太难，但是我自己没分离过（试试吧，但愿有帮助）
  
  The monocytes were isolated from fresh, heparinized blood
  by adherence to plastic at 37°C in RPMI 1640 containing 10% FCS.
  After incubation the supernatant was removed and Hanks’ solution (4°C with 1% FCS) was added.
  The cells were detached by cooling at -20°C for 15 min
  and then gently vibrating the culture plate.
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  Title: Identification of functional domains on human interleukin 10
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  Proc. Natl. Acad. Sci. USA
  Vol. 94, pp. 14620–14625, December 1997
  Immunology

• 一叶 (2012-11-02 10:58:36)

  
  正好，我们一起来讨论一下，我也想等到大量的单核细胞，我分的是外周血的。有一篇文献说用明胶包被培养瓶后培养PBMC可得到质量很高的单核细胞，只有一篇这莫说，我想这么做但没有把握，不知有没人做过。

• 园丁## (2012-11-02 10:59:01)

  
  我做过尼龙毛分离pbmc中T/B淋巴细胞，第一步就是要贴壁去除Mon
  
  三种细胞的黏附性分别是：Mon>B>T
  用明胶包被，可能就是想提高吸附Mon的比例吧。
  
  我没试过，不过照道理应该不错，
  我在贴壁后，可以去除pbmc中绝大多数Mon,
  那么，收集被吸附的细胞，应该是高浓度的Mon了，
  是否会混有B细胞，怎么去除？恐怕还得再动动脑筋喽。
  
  先动手试试，有了新眉目尽快联系吧，期待中。。。

• 一叶 (2012-11-02 10:59:28)

  
  有没见这方面的资料阿？我想确认一下才敢作，因为又有人在明胶包被之后又用纤连蛋白包被，说单核细胞有纤连蛋白受体可结合到纤连蛋白上，那只用明胶包被又怎么解释？

• 了了 (2012-11-02 11:04:36)

  
  我是用的淋巴细胞分离液做的，1500g，25min，分层很好，但是下一步就做不好了，就是将获得的单个核细胞放入加有小牛血清的1640培养基中，使其在放有载玻片的培养皿中贴壁，但是几次效果都不好，染色后的单核细胞很少，而且细胞破坏的很厉害。

• 园丁## (2012-11-02 11:04:59)

  看来，我们都有一个共识：Mon可以通过贴壁来获得。
  下面就是怎样贴壁最好：纯度高，损伤小，方便，廉价。
  
  我是用塑料的培养皿，新分离的pbmc，1640含10％NBS，37度，孵育1h，
  轻轻晃动培养皿，小心吸出上清。
  （该上清中绝大多数Mon已经顺利去除）
  
  从我找到的那篇文献看来，Mon对“塑料”吸附性极强：需要－20度冻15min，才能掉下来！（我没试过）
  推荐：试试塑料制品，或者在玻璃片表面处理处理。（明胶啦，纤连蛋白啦，先选最简单，最便宜的试试，不行的话，再有选择的加以改进）
  
  期待听到好消息，祝好运！

• abc816 (2012-11-02 11:05:27)

  单纯靠对朔料的吸附恐怕产量很低吧，有很多文献是PBMC接种在24孔板培养，帖壁2小时单核细胞大概只胜5％。我想知明胶包被后的获得量啊

• 园丁## (2012-11-02 11:05:48)

  
  “贴壁后剩5％”，是指上清中只剩5％的Mon，还是指黏附在板子上的?
  
  要是前面一种情况，那说明大部分Mon已经粘在了板子上（这不正是我们想要的结果吗，我自己的经验也是符合的）。
  要是后一种，那么就不得不再想想其它的法子了。

• 了了 (2012-11-02 11:06:10)

  
  它说2×106每孔的细胞接种在96孔板两小时后去上清，帖壁细胞有0.3－1.0×106个细胞，如实这样我得试验就麻烦了，我得单核细胞要达30×106个才行，200毫升血这么算是搞不出来的，所以我想知明胶包被是不是真的可以提高产量

• woshituzhu (2012-11-02 11:07:01)

  
  我用的是淋巴细胞分离液的方法,1500转,15-20分钟,分层效果还可以,然后取中间白膜层,然后用24孔板进行过夜培养,贴壁细胞即单核细胞,然后用胰酶进行消化.

• 园丁## (2012-11-02 11:07:24)

  我简单的估算了一下：
  1ml全血正常分离得到1-2,000,000个pbmc
  其中，淋巴细胞比较多，占75%
  Mon很少，只相当于淋巴细胞的1/20（最多最多只能达到1/5，也就是pbmc的15%）
  
  这样算来，2,000,000个pbmc顶多含300,000个Mon。
  （与你说的文献一致，当然其中若混有其他黏附性细胞，如B细胞，贴壁的总数要多一些）
  
  所以，我觉得要是1ml全血能得到300,000 Mon，已经是很高的产量了（接近于100%的获得率）。那种方法值得试试！
  
  至于全血，你就想想办法吧，不行就去血库买。（总不要把自各儿抽干吧！）

• 了了 (2012-11-02 11:07:46)

  
  兄弟，你真是同情我，谢谢！
  那种方法我就是没把握啊，有人这么做过就好。