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【求助】为什么单个核细胞染色染不上

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-11-06 13:03    作者: lxh031    来源: 分析测试百科网

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【求助】为什么单个核细胞染色染不上
我用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，96孔板做人外周血单个核细胞（主要是单核细胞）的粘附功能测定，培养箱放3小时后用文献说的结晶紫（0.5% in methanol)染色30分钟，为什么视野内有的细胞染色很深，有的根本染不上颜色？对于这个染色问题，我已经用了不同的浓度（0.1%~0.5%)及不同的染色时间(5min~1h,甚至气的我用过夜染）去试，但结果还是不理想啊。求助各位专家有没有其他好的方法染单核细胞？用多少 nm波长去测OD值?谢谢！
如果哪位战友的方法确实可行，愿意转移5积分！
各位高手帮忙啊！！
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  • ero11 (2012-11-06 13:04:01)


    你把你的整个条件说仔细点!
    结晶紫染色很简单!O.D. 你用550nm, 575nm 或595nm 应该差不多! (根据你具体的条件应该在575附近有偏差).浓度你用0.1%就行, 染5-10分钟就可以.细胞染色程度不同是正常的, 说明细胞存在生长的不同时期, 还有一些细胞已经死亡!(染色非常深的!)
    你对着什么对黏附功能测定? VITRONECTIN, FIBRONECTIN 还是FIBRINEGIN? 一般一小时足够! 然后你用什么固定? 2%PFA么? 对照用什么?
    说的详细点也许我能帮你!

  • lxh031 (2012-11-06 13:04:40)

    你把你的整个条件说仔细点!
    结晶紫染色很简单!O.D. 你用550nm, 575nm 或595nm 应该差不多! (根据你具体的条件应该在575附近有偏差).浓度你用0.1%就行, 染5-10分钟就可以.细胞染色程度不同是正常的, 说明细胞存在生长的不同时期, 还有一些细胞已经死亡!(染色非常深的!)
    你对着什么对黏附功能测定? VITRONECTIN, FIBRONECTIN 还是FIBRINEGIN? 一般一小时足够! 然后你用什么固定? 2%PFA么? 对照用什么?
    说的详细点也许我能帮你!

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    谢谢先！
    我现在是预实验，96孔板是普通的细胞培养板（cell culture treated)，先做非特异性粘附，再做试剂盒（主要是试剂盒太贵了。）试剂盒上包被的是beta-1 integrin，OD用550nm或595nm我是知道的，我是问有没有其他染色剂法去染色？用多少nm去测OD值？
    结晶紫是用纯的甲醇配的（老板以前实验室用的方法），甲醇也可以固定细胞，配成0.5%，用之前以1：4.5的生理盐水稀释染液，染10分钟，发现染色不均。后来改用20min、30min感觉还是不行，有的染的很轻，有的很重。这可能就是你说的细胞处于不同的生长周期导致细胞膜的通透性不一样。后来我又用1XPBS配0.1%结晶紫，染色之前用4%多聚甲醛固定30分也不理想。
    不过还是要谢谢你，下周我还要做一二次，到时成功可以5分全部转移给你的。

  • ero11 (2012-11-06 13:05:09)

    如果你是对INTEGRIN做的话, 一般可以用EDTA(1-5mM)做阴性对照, 就是用含EDTA的溶液(PBS)来悬浮细胞, 这样如果有细胞黏附的话应该看做非INTEGRIN作用的结果,可以作为阴性对照.结晶紫的作用特点是迅速而简单! 因为你检测的并不是一个细胞, 而应该至少是一万个细胞, 因此你得到的OD值是一个统计结果, 你不需要关心哪个染得重, 哪个染得轻, 统计的结果会给出一个趋势来!用PFA固定的作用不是为了染色, 而是要将没有黏附的细胞在染色之前洗掉!洗的时候要注意不能狠, 否则把贴上的细胞也洗掉了别怨我!
    其它方法也有啊, 你喜欢麻烦的, 可以这样做: 用B1-INTEGRIN的抗体做竞争性结合实验, 然后加带标记的二抗, 看你标什么了, BIOTIN啊, 碱性磷酸酶啊什么的, 然后显色, 再测, 很麻烦, 而且精度不一定高!
    愿意的话, 可以就你的实验细节进行讨论!

  • ero11 (2012-11-06 13:05:30)

    对了，我们家领导让我问你是不是染后直接就上读板机测OD值了，我说不能吧？！染色后应该漂洗，然后加0.1 %SDS裂细胞，（有时需要加异丙醇），镜检后确认胞内染料基本全部释放后取部分上读板（分光光度计）测OD值。直接测是不行的！ 我说你肯定没有问题啦！AM I RIGHT？

  • 831226 (2012-11-06 13:06:01)

    染色后，我是用自来水洗了3遍的，镜下观察细胞染色形态，老板看后说染色不均。对我说你没必要测OD值了。我原来的方案是用纯甲醇裂细胞的，用酶标仪595nm测OD值。

  • ero11 (2012-11-06 13:06:29)


    I am very glad that you've got something helpful to your experiment. Good luck!

    BTW, thanks for your points, now I've got 2 digital points and looks pretty good.

    Hope everyone else know that helping each other means a lot at this forum.
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