显微标本制作技术 2

2.2.5固定的注意事项
(1)固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。
(2)材料大小以直径不超过5mm为宜，材料与固定液的比例为 1:20。
(3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。
(4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。
(5)含有气泡的材料投入团定液后，材料不会下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进行抽气。


(6)固定时，要防止材料变形。
(7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液2—2h后，再将其修成小块材料继续则定。
(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净后．再行固定。
(9)材料投入固定液后．须经常摇晃。
(10) 容器外需贴标签。
2.3 脱水
脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。
现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。
脱水的过程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100%
脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。

2.4 透明
透明是用一种即能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。
其过程为： 1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯
二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。

2.5 渗蜡
将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。 石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60°c）中进行，以保证石蜡处于液态中。

2.6 包埋
样品经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以利于后边的切片，包埋可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。
将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。

我们可以看到：
①水和酒精可以相溶。
②酒精和二甲苯相溶。
③二甲苯和石蜡可以相溶。
因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。
水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。

2.7 切片
修块： 切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。
固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。
切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。
贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。