显微标本制作技术 3

2.8.1染料、染色液染料必须具备两个条件：
①要具有颜色
②和被染物体之间具有亲和力。
如果只有颜色而与被染物体之间无亲和力，那只能是颜料或合色物质，而不是染料。染料的颜色和亲和力都是由分子结构决定的，即由产生颜色的发色团和与组织产生亲和力的助色团所决定。
发色团：能使染料分子产生颜色的原子团称为发色团，也就是能吸收一定波长的光线并因之而呈现颜色的化学结构。
助色团：能使染料对织物纤维或组织成分产生亲和力的原子团称为助色团，也就是使化合物具有成盐性质的原子团。

2.8.2染色剂的分类
2.8.2.1根据来源分
(l)天然染色剂
此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋红。
(2)合成染色剂
全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。
除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。
2.8.2.2根据用途分
(l)细胞核染色剂
用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。
(2)细胞质染色剂
用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。
（3）脂质染色剂
用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。

2.8.2.3根据染色剂的化学性质分
碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。
碱性、酸性和中性染色剂都是由一种酸和一种碱所构成的盐类。
碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别，就在于染色剂的主要有色部分是阳离子还是阴离子。若染色剂电离后，其分子的主要部分成阳离子为碱性染色剂．若电离后，其分子的主要部分为阴离子即为酸性染色剂。

2.8.2染色原理
有关染色的理论至今是一个并末完全清楚的很复杂的问题。目前一般还是从物理和化学的作用来解释各种组织或细胞的染色现象。
2.8.2.1染色的物理作用
此理论认为组织细胞的染色是以物理作用为基础的，主要是依靠下列三种物理作用的一种或全部，使染色剂进入组织或细胞内。
(1)毛细管作用及渗透作用 但染色剂与组织细胞没有牢固的结合
(2)吸收作用 又称溶解学说。这种学说认为组织细胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织吸收染色剂，作牢固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同，但不一定和干燥染色剂的颜色相同。

例如，品红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的品红则为绿色。苏丹类染色剂使脂质着色，是一种溶解现象。因为苏丹类染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度。当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时染色剂就从酒精中溶解到脂质中，从而使其着色。
(3)吸附作用 吸附作用是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液(染液)中吸附一些小颗粒(化合物或离子)到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。


2.8.2.2染色的化学作用
化学作用的主要理论根据 是染色剂的性质可分为酸性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分)较牢固地结合。
例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(曙红)的亲和力很大，易于着色。

所以，在苏木精—曙红(H．E．)染色中，细胞核被碱性染色剂苏木精所染，细胞质被酸性染色剂曙红所染。这也就是细胞核是嗜碱性的，细胞质是嗜酸性的。除染色质外，粘液和软骨的基质等都是嗜碱性的，细胞质内含的某些颗粒也为嗜酸性。须注意的是嗜碱性和嗜酸性是相对而不是绝对的，若细胞在碱性染色剂溶液中停留过久，则细胞质也可染上碱性染色剂的颜色。某些细胞(如血细胞）具有特殊性质，能和中性染色剂发生亲和力而结合。
由此可见，细胞各成分的染色强弱是与细胞成分及染色剂的性质有密切关系：两者之间的亲和力强，染色就深；亲和力弱或无，染色也就浅或无。
但是，染色的实际情况是极为复杂的，组织细胞的染色作用，还随所用溶液的pH值而变动。

2.8.3染色剂和染色液的配制
Deiafield氏苏木精
Deiafield氏苏木精配方
苏木精 4g
无水酒精 25m l
10％铵明矾(硫酸铝铵)水溶液 400m1
配制时先将苏木精溶于无水酒精，待先全溶解后加入10％铵明矾水溶液，充分搅动混合后，注入细口瓶内，瓶口用纱布封住。然后将瓶置于温暖有光处3—4天后过滤，滤后再加入100 m1甘油和100ml甲醇，混合均匀后，瓶口仍用纱布封口，再置于光线充足处1—2月使之成熟。待颜色变成紫褐色时即为成熟。成熟后过滤，塞紧瓶口置于阴凉处贮存， 可长期保存，多年不坏。此液着色力较强，染数分钟即可。也可用染液l份加蒸馏水3—5份稀释后使用，染色时间需延长一至数小时。此液染细胞核及嗜碱颗粒效果良好。染植物细胞的纤维壁比用其它任何染液着色更好。

2.8.4 染色
切片可用不同方法，使其干燥，然后进行染色。因为每一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才能染色，染色的方法很多，要根据每张标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精，伊红染色（简称 H·E 染色）。苏木精使细胞核显深紫色，伊红使细胞质显粉红色，以此显示清晰的细胞形态和核的大小，位置，染色后再根据制片的基本原理，使带水的载片经历脱水→透明步骤最后用树胶封片。

其步骤如下：
二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→苏木精染液→0.01%盐酸→0.01%氢氧化钠→蒸馏水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→伊红染液→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→二甲苯→二甲苯→封片

2.9镜检、贴标签、干燥、记录。