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【求助】流式测凋亡为何左上象限出奇的高？？
最近做了两次流式，都以失败告终，现求教以下问题【求助】流式测凋亡为何左上象限出奇的高？？
1 第一次流式：采用对照组（未加药，但加了溶解药物的DMSO）做PI单样管时，可能PI加了2次（一次10ul）这会导致颜色补偿过度或不足吗？对照组和给药组的左上象限细胞比例很高，与此有关吗？
2 缩短消化时间后的第二次流式：对照组和给药组的左上象限细胞比例有所减低，仍偏高，分别是对照组：3.61％，20um实验组：21％，30um实验组15.7％，40um实验组：27.9％（第一次的对照组：13.2％，20um实验组：45.1％，重复一次的对照组19.9％，20um实验组66％）
3 PBS洗的目的是什么，洗一次可以吗？我怕损失细胞。
4 我是用的12孔板，第一次用的是3×10E5/孔，孔底细胞挤满了，第二天中间死了很多细胞。第二次用的是2×10E5/孔，孔底细胞仍很满，第二天中间也有很多死细胞，在同步化前和加药前都吸了中间的死细胞，不过吸的似乎不充分，这样做是不不正确？我们这的流式细胞仪只跑2×10E4个细胞，感觉没必要用六孔板板种1-5×10E6个细胞（可能也种不下）。下次做考虑种1.5×10E5/孔或1×10E5/孔，不知行不？
5第一次是Annexin v和PI同时孵育15min，第二次先孵育Annexin v 15min，后孵育PI 5min，这与第二次左上象限细胞比例下降有关吗？
6 第二次对照组做Annexin v/PI双染时我看见左上象限紧邻Y轴（PI）细胞散点成线状，不知这是否就是补偿过度或不足的表现？让老师微调了一下后左上象限比例由12.1％降至3.61％，可是实验组的微调却调不动。
附流式数据:第一次
左上 右上 左下 右下
A-，PI+ ； A+，PI+ ； A，PI-； A+，PI-
对照组(裸细胞) 0.16 0.18 99.5 0.13
对照组（PI染色） 21.9 0.05 78 0.05
对照组（Annexin染色） 0.04 0.05 91.1 8.80
对照组（双染） 13.2 3.13 74.1 9.6
对照组（双染，重复） 19.9 1.33 76.3 2.43
20um实验组（双染） 45.1 2.93 50.2 1.8
20um实验组（双染） 66 0.92 32.2 0.97
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最新回复
junjie05 (2013-1-08 13:48:29)
左上 右上 左下 右下
A-，PI+； A+，PI+； A-，PI-； A+，PI-
对照组(裸细胞) 0.03 0.20 99.2 0.61
对照组（双染） 12.1 3.31 79.9 4.70
对照组（双染，微调后） 3.61 5.75 86.7 3.91
20um实验组（双染） 21 9.12 68.5 1.45
30um实验组（双染） 15.7 11.3 70.8 2.25
40um实验组（双染） 27.9 15.7 54.8 1.6
接下来我该怎么改进呢？
tudou85 (2013-1-08 13:48:48)
看了你的数据，我觉得第一跟你的细胞状态很有关系，你说对照组中间也有很多死细胞，而且你做实验时也吸上来了，坏死的细胞和凋亡的细胞是不一样的，如果细胞坏死破裂很多的话这时左上象限PI就很高了，再则，PI染的时间5-10分钟就可以了。我做的时候是采用PI和Annexin V分开染，PI先染或离心去掉染液，然后再加结合液和Annexin V10分钟后上机检测。PBS洗的目的有利于Annexin V的结合反应，为了 缩短实验时间和较少细胞损失，我一般也就洗一次。
最后，我个人的观点是做实验时，细胞状态一定要好的情况下去做，不要勉强，这一既浪费试剂和时间，也往往得不到好的可靠的结果。你做的是贴壁细胞，中间有好多死的细胞，你可以先接种细胞，待细胞贴壁好了，然后再换一次液，这样就把那些死细胞去掉，接下来再加药物。
junjie05 (2013-1-08 13:49:18)
QUOTE:
请问你种的细胞密度是多少呢？avi317 (2013-1-08 13:49:42)
相关疾病：
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紧急求救,流式测凋亡实验含药培养液中血清含量多少比较合适啊?血清会干扰药物诱导肿瘤细胞凋亡的吧???
早期凋亡的Annexin单阳性对照怎么弄啊??有什么尺度说是早期凋亡吗???
对照组(裸细胞) 和阴性对照组需要双染吗,有啥区别?????
多谢了啊,请高人帮忙回答下啊!
tudou85 (2013-1-08 13:50:11)
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1X10E6
tudou85 (2013-1-08 13:50:42)
肿瘤
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紧急求救,流式测凋亡实验含药培养液中血清含量多少比较合适啊?血清会干扰药物诱导肿瘤细胞凋亡的吧???
早期凋亡的Annexin单阳性对照怎么弄啊??有什么尺度说是早期凋亡吗???
对照组(裸细胞) 和阴性对照组需要双染吗,有啥区别?????
多谢了啊,请高人帮忙回答下啊!
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血清就按你正常培养这株细胞需要的浓度，血清应该不会干扰药物的作用，做Annexin/PI的实验设计按楼上的就可以了，对照需要双阴，Annexin 单阳，PI单阳，双阳四个，这些也是流式上机分析需要的。实验组就分为药物处理和不处理的。早期凋亡就是Annexin（+）,PI(-)即右下象限，双阳的是晚期凋亡。
junjie05 (2013-1-08 13:51:20)
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胃癌
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1X10E6
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你是种的几孔板呀？怎么我用1×10E5种12孔板都种不下，头天种，第二天中间总是有很多死细胞！！我的是AGS胃癌细胞！！
tuuu2 (2013-1-08 13:51:40)
cj_mondy (2013-1-08 13:52:02)
1、PI多加了不影响实验结果
2、有人认为左上象限是死亡细胞（我认为是正确的），所以缩短药物作用时间或减少药物量试试？
3、有些消化液中含EDTA会络合钙离子，要清除之；另外可溶性PS过多会中和试剂中的ANNEXIN V
4、只要实验条件一致就可以了，要取一起取，要丢一起丢。
5、结果一样
6、可能是补偿过度
7、裸细胞设置MARK不合适
前两天最近刚写了个关于如何确定ANNEXIN V/PI实验中MARK和补偿的东东。不知能否发表？
dongdongqiang (2013-1-08 13:52:31)
QUOTE:
能不能分享下你写的ANNEXIN V/PI实验中MARK和补偿的东东，最近流式测凋亡结果总不好，不知道怎么样的结果才算是好的，操作仪器的老师也不太熟练，郁闷中~~~~~~~~~~~~··【求助】流式测凋亡为何左上象限出奇的高？？