【求助】养过原代上皮细胞的大神

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• wood533 (2013-1-08 15:01:41)

  细胞长得比较慢，分布也不太均匀，有一孔没有传代，只是原位消化了一下，另一孔传了第一代，照片没拍，显微镜不太好，看的很不清楚

• ending (2013-1-08 15:04:06)

  
  老化细胞容易出现空泡
  第一次传代就出现，检查一下培养基有没有问题？PH对不对？拿你的培养基试试别的细胞
  或者消化的时间是不是太长？内皮细胞很娇的~

• wood533 (2013-1-08 15:05:06)

  老化细胞容易出现空泡
  第一次传代就出现，检查一下培养基有没有问题？PH对不对？拿你的培养基试试别的细胞
  或者消化的时间是不是太长？内皮细胞很娇的~
  
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  我养的是上皮不是内皮，现在用的是BEGM，专门用来培养上皮细胞的，估计别的细胞养不活吧。消化的话时间是挺长的，一共消化了十几分钟，而且一部分细胞掉下来较早，还有一部分却要等好久，我都是分批收集起来离心再重悬的。唉，最近不知道怎么了，连第一批细胞都长不起来了，但是步骤跟材料都是一样的，郁闷……

• ending (2013-1-08 15:05:46)

  额，看错看错~
  消化十几分钟是有点长啊，原代细胞因为状态不一致，所以我们多采用多步消化法
  加胰酶，看见一部分细胞变圆（不要全部都变圆）以后，加血清终止，然后吹打，吸出转到离心管中。如果有还有细胞贴壁，加PBS清洗2次，再加胰酶消化，如此重复，把几次消化下来的细胞集中再种到瓶子里去

• wood533 (2013-1-08 15:06:16)

  QUOTE:

  原帖由 ending 于 2013-1-8 15:05 发表
  额，看错看错~
  消化十几分钟是有点长啊，原代细胞因为状态不一致，所以我们多采用多步消化法
  加胰酶，看见一部分细胞变圆（不要全部都变圆）以后，加血清终止，然后吹打，吸出转到离心管中。如果有还有细胞贴壁，加PBS清洗2次，再加胰酶消 ...

  你养的也是原代吗？

• ending (2013-1-08 15:12:55)

  
  内皮和平滑肌

• ero11 (2013-1-08 15:16:30)

  
  我养的是原代上皮细胞，用的和你的培养基差不多，PrEGM，你用的是胶原蛋白酶还是胰酶啊？

• wood533 (2013-1-08 15:17:11)

  我养的是原代上皮细胞，用的和你的培养基差不多，PrEGM，你用的是胶原蛋白酶还是胰酶啊？
  
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  我用的是链酶蛋白酶，你养的好么？

• ero11 (2013-1-08 15:18:18)

  我用的是Ι型胶原酶，0.1%，这个是最温和的消化酶了，对上皮来说比较合适，你的消化酶我没用过，是不是消化的过了？

• wood533 (2013-1-08 15:19:34)

  QUOTE:

  原帖由 ero11 于 2013-1-8 15:18 发表
  我用的是Ι型胶原酶，0.1%，这个是最温和的消化酶了，对上皮来说比较合适，你的消化酶我没用过，是不是消化的过了？

  应该不是，因为铺板之后还能长个三五天，但是之后就好像生长停滞了，长不起来了……而且看了挺多文献也都用的链酶蛋白酶……你消化了之后用的什么培养基，BEGM吗？还是自己配的DMEM加生长因子啊？

• Ao7 (2013-1-08 15:20:57)

  
  PrEGM，特制的培养基。你的细胞传代以后贴壁情况如何？刚铺板后生长速度怎么样？

• wood533 (2013-1-08 15:22:31)

  PrEGM是你自己配的吗？我的细胞刚铺板感觉还好，长个五六天还能看到岛状的贴壁细胞团，但是继续养下去就不好了，不知道为什么，你的呢？

• ero11 (2013-1-08 15:23:17)

  PrEGM是你自己配的吗？我的细胞刚铺板感觉还好，长个五六天还能看到岛状的贴壁细胞团，但是继续养下去就不好了，不知道为什么，你的呢？

• wood533 (2013-1-08 15:24:33)

  QUOTE:

  原帖由 ero11 于 2013-1-8 15:23 发表
  PrEGM是你自己配的吗？我的细胞刚铺板感觉还好，长个五六天还能看到岛状的贴壁细胞团，但是继续养下去就不好了，不知道为什么，你的呢？

  我的到后期就不是长得慢的问题了，后面细胞就会慢慢变小然后变少然后就没了，郁闷！不过昨天我查了下你的PrEGM，好像主要是用于人的上皮细胞，你是养人的吗？

• qiangren789 (2013-1-08 15:28:00)

  楼主本人最近养的是鼠的乳腺上皮细胞，分离完细胞后开始有岛屿状的经过一次消化后大部分都变成长条的了，不知道可否赐教，还有我的消化时间用了5分钟是不是消化的长了

• wood533 (2013-1-08 15:38:28)

  QUOTE:

  原帖由 qiangren789 于 2013-1-8 15:28 发表
  楼主本人最近养的是鼠的乳腺上皮细胞，分离完细胞后开始有岛屿状的经过一次消化后大部分都变成长条的了，不知道可否赐教，还有我的消化时间用了5分钟是不是消化的长了 ...

  上皮好像本身就贴的比较牢固，5min应该不算长，我没养过乳腺上皮，不是很清楚，形状的改变我就不清楚了，sorry~

• sunnyB (2013-1-08 15:38:54)

  
  长条型 椭圆形 多角形的细胞可能是成纤维细胞