【求助】明胶铺被

最新回复

• dream2013 (2013-1-13 15:58:26)

  经搜索后找到了一些相关的答案，但还是觉得众说纷纭。
  我曾经常识过高压与过滤两种方法。其中高压之后的明胶，即使放4℃冰箱仍很澄清，这是不是明胶变性？你觉得高压可靠吗？明胶里是蛋白与氨基酸能耐住这么高的温度吗？
  另外，明胶在37℃水浴溶解澄清后，过滤仍不易通过（每50ml大约可滤到30ml），而且过滤后的明胶再放到4℃就又变为胶冻状，经37℃水浴澄清后铺瓶。这样反复三次，发现我的明胶有些浑浊，不知什么原因，是不是这样的反复水浴对明胶十分的不利？
  期盼主任能不吝赐教，以后有机会一定要多挣分，多做贡献。

• 一叶 (2013-1-13 15:58:54)

  不用过滤，高压就可以了，可靠，我都用了好几年了，而且，我这个方法教给很多很多很多人了。
  0.5-2%明胶PBS，高压消毒，4度保存，用时包被过夜(至少2h以上)，使用前用普通含血清的培养液0.5-1ml清洗一下培养包被过的培养器皿，就可以使用了。
  
  可以反复水浴，没有问题的。但是，时间也别太长了，1-2个月吧。

• dream2013 (2013-1-13 15:59:53)

  相关疾病：
  感染
  多谢，您也是养的脑微血管内皮细胞吗？我正在养，前一段时间养了牛的，结果第二次就长细胞了，但是第二次的在第二天就发现像是染菌了，因为没舍的倒掉，换液后又放了三天，结果看见有多角形细胞生长，而且有成片生长的，当时长势还不错，但是培养瓶内漂了大片物质，当时还以为是组织碎块，但是这些东西长势飞快，换液后第二天就有很多，类似树根状的。为了防止在孵箱内感染别的细胞就倒掉了。
  紧接着又做了两次牛的都没有细胞生长。
  由于牛头难消毒，而且不方便一人操作。我又尝试养大鼠的，取新生两周后的大鼠4只，结果匀浆后，再过100目和200目网时发现200目网上没东西，请问是因为大鼠太少？还是匀浆太细了？我开始是用的布式漏斗加尼龙网过滤，但尼龙网高压后易变形，我就借来别人的不锈钢网类似勺状（底是平的），网会有影响吗？
  请问你养时，取200目网上的东西后能见到微血管段吗？微血管段消化离心后有含血清的培养基悬浮铺瓶后能见到细胞吗？再是您的细胞传代时是不是也要用明胶铺被培养瓶？
  由于一直没有找到养这方面细胞的朋友，最近心情特别郁闷，特别努力可又不知问题出在哪儿。
  多谢你在我百般焦急中赐教，不盛感激！！！

• 一叶 (2013-1-13 16:00:20)

  QUOTE:

  原帖由 dream2013 于 2013-1-13 15:59 发表
  相关疾病：
  感染
  多谢，您也是养的脑微血管内皮细胞吗？我正在养，前一段时间养了牛的，结果第二次就长细胞了，但是第二次的在第二天就发现像是染菌了，因为没舍的倒掉，换液后又放了三天，结果看见有多角形细胞生长，而且有成片生长的，当 ...

  牛头的，好厉害啊，呵呵，消毒可能是不是好费劲啊。加大双抗或者给些抗真菌的吧。多洗洗吧。
  
  大鼠太小了吧，取70-100g的大鼠吧，新手的话，5只大鼠做一瓶吧。
  尼龙网没有关系的，可以看到微血管段。
  见不到细胞的，都是慢慢从微血管段中爬出来的。
  高兴的时候都铺。(养细胞还是一件比较高兴的事情吧)

• dream2013 (2013-1-13 16:00:52)

  十分感激您的回答，让我知道了不少东西，以下是我的实验步骤：
  无菌条件下取新生小牛大脑皮层灰质部，4℃ D-Hank′s液洗涤4次，至无血迹残留。剪成1mm3左右的组织碎块并置于玻璃匀浆器内，加入两倍体积的MEM培养基，匀浆上下20次？？？？？
  匀浆液先用100目（直径149μm）尼龙网布式漏斗抽滤，培养基洗涤4次，收集滤液。然后用200目（直径74μm）尼龙网布式漏斗抽滤，MEM培养基洗涤4次。细胞刮刀收集200目尼龙网上的组织（即牛脑微血管），将其置于离心管中，1500r/min离心洗涤10min。离心洗涤的脑微血管悬浮于的0.1%胶原酶中，旋涡振荡15sec以充分混匀，置于37℃恒温振荡水浴箱中振荡消化50min？？？？？
  取出后旋涡振荡15sec，1500r/min离心10min，弃上清，用20%BCS的培养基悬浮，接种于明胶铺被的培养瓶中（培养瓶中加入1%明胶 - D-Hank′s液洗涤3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明胶溶液即得明胶覆盖的培养瓶），置于细胞培养箱中，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。静置5～7天后，可见少量细胞生长，20%BCS的MEM培养液换液，以后每2～3天换液一次，至细胞长成致密单层后可传代培养。
  您能帮我看看这些步骤哪儿有问题吗？（如果换成大鼠的话）
  再是关于打？的地方，我想到的是匀浆是不是不能太细得到什么程度？如果细胞都是慢慢从微血管段中爬出来的，那是不是胶原酶没必要消化那么长时间？反而把微血管段的细胞都消化死了呀？
  我想明天重新做一次大鼠的，所以反复考虑这些步骤有无不妥之处，让主任多费心了。
  养细胞是挺高兴的，开始看见细胞时特别兴奋。可是细胞长不出来，找不到原因心里真难受。

• 一叶 (2013-1-13 16:01:09)

  
  血清浓度25%，生长因子要用够量。

• dream2013 (2013-1-13 16:02:10)

  请问，我该买那种生长因子？用到多大的量？什么厂家产的好？大约多少钱呢？

• dream2013 (2013-1-13 16:03:47)

  ,"0.5-2%明胶PBS",我不知道到底是该怎样做,能详细些吗?6孔板每孔要用多少明胶呢?不同规格的培养瓶加明胶的量是怎样算的呢?是将底部铺满为准吗?

• bamboo16 (2013-1-13 16:04:14)

  
  我也在铺板，明胶的浓度不好把握啊~