三 mRNA的分离纯化

实验三 mRNA的分离纯化
【实验目的】
1．了解分离mRNA的原理
2．学习和掌握mRNA的分离、纯化方法和技术

【实验原理】
真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5?g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中 rRNA为75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。
真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。
目前常用的mRNA的纯化方法有：
（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；
（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；
（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。
本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。

【试剂与器材】
（一）试剂
1． 0.1mol/L NaOH ，每组200mL
2． 寡聚Oligo（dT）-纤维素
3． 加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4． 洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。
5． 5 mol/L NaCl，每组10mL
6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL
7． 无RNase双蒸水(DEPC水)，每组100mL
8． 70%乙醇，每组10mL

注意：溶液5，6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜，溶液1，3，4，8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制，Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。

（二）器材
1． 恒温水浴箱
2． 冷冻高速离心机
3． 紫外分光光度计
4． 巴斯德吸管
5． 玻璃棉
6． 5ml一次性注射器

【操作方法】
（一） oligo(dT)纤维素的预处理
1． 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2． 将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。
3． 用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。
4． 将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二） 总RNA浓度的调整
1． 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。
2． 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

（三） mRNA的分离
1． mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。



总RNA (mg) 寡聚Oligo(dT)-纤维素(mL) 洗涤缓冲液1，2 (mL) 洗脱体积(mL)
<0.2 0.2 1.0 1.0
0.2-0.5 0.5 1.5 1.5
0.5-1.0 1.0 3.0 3.0
1.0-2.0 2.0 5.0 5.0



2． 转移：取1个5ml的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它固定在无RNase的支架上，再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器，推进塞子直至底部，把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA）。
3． 洗涤：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1，温和振荡，充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子，用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时准备洗脱。
4． 洗脱：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（2-3倍柱床体积）的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
5． 测定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脱液组分于4℃，2500g，离心2-3分钟，上清转移至新的离心管中，去掉残余的oligo(dT)-纤维素。
6． 沉淀：洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-20℃30分钟或放置过夜。
7． 离心收集：12000g, 4℃离心15分钟，小心弃去上清，mRNA沉淀此时往往看不见，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃离心5 分钟，小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
8． 定量：测定OD260和OD280，计算产率以及OD260/OD280的比率（同上一实验）。