来氟米特水溶液化学稳定性的研究

摘要目的：研究广泛pH范围内来氟米特的化学稳定性。方法：建立来氟米特的HPLC测定方法，测定不同温度下不同pH值时来氟米特分解的速度常数，得到不同pH值时的分解活化能及不同温度下的最稳定pH值。结果：常温（20～40℃）下来氟米特最稳定的pH范围是2.85～4.56，活化能数值恰在此范围内出现极大值。最稳定的pH范围随温度升高而向低pH值方向移动，当温度大于60℃时，最稳定pH值为1.80以下。结论：适当调整溶液的pH值可以显著改善来氟米特的化学稳定性，为其制剂学研究提供了部分依据。

　　来氟米特（leflunomide，LFM）是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异唑类衍生物，其作用机制不同于已知的其他抗炎及免疫抑制药物，对多种自身免疫性疾病有治疗作用。Ⅱ期临床试验显示LFM治疗类风湿性关节炎效果显著，现正在欧、美进行Ⅲ期临床试验。但LFM是一种前体药物，在人及动物体内转化成活性开环代谢物A771726，使LFM水溶液呈不稳定性，关于其分解的活化能（E）及最稳定pH值的研究未见报道。我们采用经典恒温法对LFM水溶液的化学稳定性进行研究，以反相HPLC法测定其含量，为新药LFM的制剂学研究提供理论依据。

　　1、材料和方法

　　1.1仪器和试药WatersMaxima820系统，包括Waters510泵，Waters486可变波长紫外检测器，U6K进样器（美国Waters公司）；UV-2100型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；CS501型超级恒温器（重庆实验设备厂）；pHS-3D型pH计（上海三信仪表厂）。LFM（药物合成室提供）；萘（色谱纯，上海试剂一厂）；甲醇（色谱纯，上海化学试剂研究所）。其他试剂均为分析纯。

　　1.2LFM供试液的配制实验在pH1.80～7.34内进行，约每隔1pH单位作一个数据点。缓冲液按英国药典(1993年版)方法配制，pH1.80～4.56用醋酸盐，pH5.88～7.34用磷酸盐，pH精确度±0.03。配制一定pH值的15.28μg/mlLFM溶液，立即封装于2ml安瓿。

　　1.3加速实验将供试液立即置于恒温水浴中，定时取样，每次10支，冰箱骤冷，终止反应，打碎混匀。加速实验温度为66，71，77，82及87℃，温度控制±0.5℃。

　　1.4LFM的含量测定方法

　　1.4.1色谱条件色谱柱ODSC18柱（4.6mm×150mm，10μm，大连化学物理研究所），流动相为甲醇∶水∶磷酸（67∶33∶0.006)，流速1.0ml/min，检测波长260nm，灵敏度0.01AUFS，萘为内标，进样量20μl。

　　1.4.2标准曲线的制备准确配制质量浓度为16.4μg/ml的萘储备液和质量浓度为38.2μg/ml的LFM储备液。精密量取LFM储备液0.025，0.050，0.100，0.250，0.500，1.000，2.000ml至10ml量瓶中，加入萘储备液1.000ml，用流动相稀释成0.0955，0.191，0.382，0.955，1.91，3.82，7.64μg/ml的标准液。以LFM的质量浓度(ρ)对其与内标的峰面积比(R)进行回归，得标准曲线方程ρ=-0.0020+0.6989R，r=0.9999（n=7）。

　　1.4.3供试液的含量测定精取供试液0.2ml，加内标萘储备液0.1ml，用流动相稀释至1.0ml，进样测定。

　　2、结果

　　2.1不同pH值时的Arrhenius方程实验得到不同pH时各温度下的分解速度常数k值，用lgk对1/T（T为热力学温度）回归，得Arrhenius方程，并根据方程计算出不同pH值的分解活化能E及248K(25℃)的t1/2。

　　2.2不同pH值时不同温度下的速度常数k根据Arrhenius方程推算出不同pH值时20，40，60，70，80及90℃下的速度常数k，作lgk-pH图，见图3。常温（20～40℃）下反应速度常数k出现极小值的pH值是2.85～4.56，LFM的分解活化能数值亦在此范围内出现极大值，此点符合化学反应动力学的一般情况，即Arrhenius方程中指前因子A（亦称频率因子）相近时，活化能高，反应速度小。LFM的分解反应速度随温度升高而加剧，稳定的pH值范围随温度升高而向低pH值方向移动，当温度大于60℃时，最稳定pH值为1.80以下。

　　3、讨论

　　LFM的含量测定方法国内未见报道，国外报道可采用HPLC法测定，但不详细。本研究选用在LFM最大吸收峰260nm附近也有较强紫外吸收的萘为内标，适当调整流动相的比例，内标萘的保留时间约9.11min，LFM的保留时间约5.92min，两峰分离完全，无杂质干扰峰，检测限达0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%（n=5)和0.86%(n=5)，方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。降解产物A771726的最大吸收波长在290nm附近，该实验条件下未出现其他的色谱峰，不干扰LFM的测定，我们将在以后的实验中建立A771726的含量测定方法。本法的建立为进一步开展LFM的制剂学、药代动力学、药效学等的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。

　　有关LFM水溶液的稳定性研究，由于专利或新药保护等问题，国外未见有类似文献报道。本实验发现LFM的分解是受pH值影响的一级反应，其分解活化能与pH值有关。但在pH1.80时，指前因子A和活化能E都特别小，此时活化能与其他pH值条件下的活化能不具可比性。由于活化能所反映的是速度常数k随温度T的变化率(dlnk/dT=E/RT2)，pH1.80时k随温度T的变化率最小，因而此时活化能亦最小，这同时说明pH1.80条件下LFM的稳定性受温度的影响最小。总之，就温度而言，LFM水溶液的最稳定pH值可取1.80或更低；但就样品的常温贮存和实验操作的一般要求而言，LFM水溶液的最稳定pH值可取2.85～4.56，此时溶液的t1/2最长。实验过程中曾对LFM在较强碱性条件下的稳定性作过观察，因其分解迅速而未做进一步的研究。