结核分枝杆菌ATP结合盒超家族外排泵的研究进展

近数十年结核病又有再次回升的趋势，尽管卡介苗和一些抗结核药物对治疗结核病起到了一定的作用，然而迄今结核病仍然是导致死亡的传染病之一。结核病主要是由于感染结核分枝杆菌所导致，而结核分枝杆菌发展到现在出现了许多MDR和XDR的菌株。此外，结核分枝杆菌对大多数的抗生素本身都有抗性，一般情况下，是由于它们的细胞被膜对抗生素的渗透起到有效的阻碍作用。外排泵就是能够通过膜蛋白依靠能量挤压出单一的抗生素或者是一些化学物质和非本身所含有的物质，与细胞壁协作，作为影响渗透的阻碍物增加了固有的药物抗性。外排泵主要分为5种类型：ATP结合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily， ABC）、小多药耐药家族、主要易化子超家族、多药及毒性化合物外排家族和耐药节结化细胞分化家族。而ABC是外排泵主要的大家族，对我们研究外排泵耐药机制有着重大意义，为新药的开发奠定基础。

1 ABC外排泵

近年来，主动外排是结核分枝杆菌耐药研究的难题，其作用机制还在进一步研究。药物外排泵可分为ATP水解能驱动型和跨膜质子梯度能驱动型2种，前者中主要是以ABC为代表，也是近些年研究的重点。此家族中，结核分枝杆菌ABC转运蛋白对ATP结合与ATP水解的性质相同，这一发现来自于Sarin等对组氨酸和麦芽糖转运蛋白的研究。ABC转运蛋白水解ATP的能力，作为评价转运蛋白功能是非常重要的。ABC转运蛋白有2个疏水性膜生成区域（MSDs）和与其有密切关系的2个细胞质核苷酸结合区域（NBDs）。在许多细菌转运蛋白中，通过编码操纵子的基因，使这4个不同区域作为独立的多肽类被表达。然而，真核生物的ABC转运蛋白通过单一基因编码，组成一个庞大的多重区域分子。所以，许多细菌ABC转运蛋白包含2个NBDs、2个MSDs或者1个MSD和1个NBD在分子水平上也都被描述过。ABC转运蛋白被分为泵入部分和泵出部分。泵入部分仅在原核生物中被发现，其也涉及对细胞外分子的摄取。泵出部分在真核生物和原核生物都被发现，它们从细胞质中排出分子。

2 结核分枝杆菌中ABC外排泵的抑制剂

ABC转运蛋白在真核生物和原核生物中都有发现，组成了一个庞大的多亚基家族，转运各种分子（离子、氨基酸、多肽类、抗生素等）穿越生物膜。由于细菌需要摄取各种基础营养物质，这方面ABC转运蛋白也起到了重要的作用，对这些转运蛋白在生理学功能上有一定的影响。

2.1 铁离子对ABC转运体的影响 转运铁离子的机制中，IrtA作为一个完整的ABC转运基因，而IrtB作为一个不完整的ABC转运基因.Rv2895c作为一个可与含铁细胞结合的基因，这些都对ATP外排泵起到一定的影响。研究表明，铁离子是决定病原菌毒力的关键因素，结核分枝杆菌要生存就必须与宿主的巨噬细胞进行对抗，这样就需要多种的作用机制，包括它能够从宿主中获得营养物质。所以，宿主使之与铁离子分离作为一种免疫反应对抗入侵的病原菌，从而进行自我保护。铁离子的存在对于结核分枝杆菌有至关重要的作用，所以细胞内的病原菌像结核分枝杆菌的生存，就需要很好的平衡铁代谢。

2.2 磷对ABC转运体的影响 磷是细菌生长所需要的物质，磷酸盐和亚磷酸盐都可以作为磷源。细菌需要在细胞内积累大量的磷进行储存，这样在外环境中的磷被消耗尽之后也能维持生长。在ABC转运体的运输系统中，已有很多控制磷的转运的基因被研究，phnDCE操纵子编码了一个磷的ABC转运蛋白，在磷匮乏的情况下会诱发突变；Phn和Pst作为磷的转运系统，当它们被敲除后仍然表现出对磷的摄取有很高的效率。然而，分枝杆菌摄取磷也有它的特殊性，化合物不能够为分枝杆菌提供磷源。

2.3 碳水化合物对ABC转运体的影响 从分子水平上研究控制糖转运的蛋白很重要，但是其发生机理还不是很清楚。通过对结核分枝杆菌调节碳水化合物摄取的蛋白的分析，有一个很广大的基质光谱为早期观察腐生分枝杆菌提供了分子基础，它们被用作惟一的碳源和能量源。结核分枝杆菌基因组编码5个转运蛋白涉及糖的摄取，而吞噬体不能够提供一个富于各种糖的环境。所以，通过结核分枝杆菌的内膜对碳水化合物转运体的基质特异性的实验分析，显示了在人分枝杆菌的吞噬体里碳源的有效性。LpqY-SugA-SugB-SugC ABC转运蛋白调节结核分枝杆菌对海藻糖的摄取，ABC转运蛋白LpqY-SugA-SugB-SugC也被推测涉及二糖麦芽糖的运输。LpqY-SugA-SugB-SugC ABC转运蛋白还是结核分枝杆菌毒力的重要评定。由于在毒力方面它们的重要性，LpqY-SugA-SugB-SugC ABC转运蛋白可以被表示为一种新的靶点，用于对急性分枝杆菌传染的化学治疗，也可以作为潜伏性传染的治疗。

3 ABC外排泵的作用底物研究

对于ABC外排系统在结核分枝杆菌中的作用底物，国内外进行了一系列的研究。相关研究表明，结核分枝杆菌在对氟喹诺酮类、新生霉素、吩噻嗪类等抗生素的耐药性中，ABC转运蛋白都对其有外排作用，对研究结核分枝杆菌的耐药机制方面有一定的启示。现将各ABC型外排泵底物总结见表1。

表1 各ATP结合盒超家族型外排泵底物



3.1 耐氟喹诺酮类早期，外排泵导致的结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的外排还很少，人们对其没有足够的重视。Pasca等研究表明，结核分枝杆菌H37Rv株基因组中存在编码氟喹诺酮外排泵蛋白的操纵子，属于ABC转运子家族，其中有3个共同表达的基因，Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c。研究该蛋白功能时发现，其过度表达的结核分枝杆菌，环丙沙星的耐药性很高，而仅Rv2686c过度表达时，环丙沙星耐药性一般。对诺氟沙星则不管是表达完整的操纵子还是仅为Rv2686c，突变株均低水平耐药。对这一现象，Pasca等分析可能是由于Rv2686c蛋白与宿主细胞内相关蛋白相互作用，形成一个药物转运体的缘故。经过利血平和维拉帕米处理，则可以诱导环丙沙星MIC降至与野生株一致的水平，表明该转运体有主动外排药物的作用。磷酸盐转运体Pst发现于多种微生物中，主要涉及磷酸盐运输，现发现胞内氟喹诺酮外排可能还与其有关。PstB是Pst系统中核苷酸结合亚基，含有ATP酶的活性。Pst系统中编码ATP酶亚基的pstB基因的突变导致mRNA水平明显升高，染色体扩增。Bhatt等发现该基因的突变导致对磷酸盐的摄取提高，而Pst的失活将丧失对磷酸盐摄取的高度亲和力，导致菌株对氟喹诺酮非常敏感。Poole也发现耻垢分枝杆菌Pst高表达导致环丙沙星耐药，而用外排泵抑制剂维拉帕米可逆转此耐药。