对肌萎缩侧索硬化发病机制的新认识

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）为一种累及皮质、皮质脊髓束、脑干、脊髓运动神经元的神经变性病，临床表现为四肢及躯干肌肉萎缩，导致运动功能严重障碍甚至呼吸肌麻痹，患者多于3-5年内死亡。据统计其发病率为（1.5-2.5）/10万，5%-10%为家族性ALS（fALS）.其余90%以上为散发ALS（sALS）。该病距首例报道至今已有147年，直到近18年才取得了重大进步：1993年有学者发现部分fALS患者有Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变，开始了ALS分子生物学研究的新时代；2006年又发现绝大多数sALS患者神经元和胶质细胞内有反式激活反应（TAR）-DNA结合蛋白43（TAR DNA binding protein-43，TDP43）包涵体，找到了主要疾病蛋白；2009年有学者发现ALS有FUS（fused in sarcoma protein/translocated in liposarcoma，也称FUS/TLS）基因突变，TDP-43阴性及阳性的ALS有FUS包涵体，从而提出了ALS为TDP-43及FUS蛋白病的新观点，并使研究方向移向了RNA加工的领域。但是对于TDP-43及FUS蛋白累积的性质、神经元毒性机制及累积蛋白间的相互关系还缺乏足够认识，大部分ALS突变基因尚未找到。国内虽已有相关的文献复习及SOD1、senataxm基因、风险SNP、CYP2E1基因多态性分析的论著，但有关蛋白病研究报道尚少。现就ALS近年进展的主要观点及研究方向的个人认识作一介绍。

一、深入认识SOD1基因突变的神经元毒性机制，研究不同类型神经元在ALS发病中的地位

SODI是在1973年被发现的抗氧化蛋白，由154个氨基酸组成，相对分子质量34 000，SOD1基因定位于21号染色体，含5个外显子。15%-20% fALS、3% sALS有SOD1基因突变（称为MTSOD1-ALS），是fALS中一个最大的亚组，大约有150个不同的突变位点。其发病机制目前已作了广泛研究，虽远不十分清楚，但可确定的是其机制并非酶活性丧失，而是毒性蛋白功能放大：（1）由于邻近神经元的胶质细胞突触处谷氨酸转运体（EAAT2）缺陷，使释放的神经递质谷氨酸不能及时得到清除，产生毒性作用，运动神经元兴奋性过度升高，受体反复激活，细胞内钙离子超载引发中毒性的级联反应； （2） MTSOD1形成错误折叠蛋白，聚集在病变细胞的内质网，发生应激反应，或与调节内质网应激的换能器及其识别体系的3个定位于内质网的跨膜蛋白IRE1（inositol-requiring protein-1）、PERK（PKR-related ER kinase）、ATF6（activating transcription factor-6）、内质网内腔多肽链结合蛋白相互作用，抑制内质网相关的降解，产生内质网应激（但内质网应激为一加速疾病进展或终末期的因素，并不启动疾病）；（3） MTSOD1聚集物累积于线粒体（特别是脊髓细胞的线粒体）的膜间隙，导致线粒体结构和功能损害，线粒体钙离子缓冲能力、ATP、能量障碍，融合、裂殖能力下降，线粒体蛋白成分改变、输入蛋白量下降；MTSODI毒性使轴突转运中细胞骨架蛋白结构变化，动力蛋白及动力蛋白激活蛋白聚集，顺向或逆向的轴突转运减慢；（4） MTSOD1抑制细胞质内蛋白酶体降解通路，抑制错误折叠蛋白的清除；MTSOD1产生细胞外的超氧化物，增加氧化还原应激；（5）细胞内或外的MTSOD1通过不同途径增加活性氧自由基的产生和释放，使小胶质细胞产生炎性细胞因子的级联反应，使运动神经元对谷氨酸中毒易感，抑制星形胶质细胞EAAT的功能和表达，进一步加重神经毒性。

MTSOD1-fALS的相关研究发现ALS主要病变在运动神经元，但发病及疾病进展的原因并非运动神经元本身，而是由不同类型的神经元共同参与，各自作用不同，因而提出了细胞非自主性功能（non-cells-autonomous function）的机制（或称非细胞自主变性）。一般认为星形胶质细胞在疾病的启动或进展中有重要地位，而小胶质细胞在终末期有致炎及清除变性细胞的功能，施万细胞的表达可使病程减慢，肌肉、上皮细胞的表达不影响发病和疾病的进展。G85R、G37R转基因小鼠的运动神经元、中间神经元、胶质细胞、小胶质细胞敲除突变基因实验，证实了不同类型细胞在疾病过程中的上述地位。对MTSOD-G93A小鼠症状前期、症状期、晚期、濒死期的对比观察发现，症状期运动皮质、脊髓、三叉神经运动核星形胶质细胞增生增加，而晚期、濒死期脊髓、三叉神经运动核以及濒死期小鼠的丘脑腹侧星形胶质细胞增生增加，伴运动神经元死亡增加，而小胶质细胞激活增加仅出现在濒死期，提示星形胶质增生先于运动神经元变性或同时出现，而小胶质细胞增生发生晚，出现在运动神经元变性后。这些实验均证明了星形胶质细胞在调节运动神经元非细胞自主变性中有重要地位，因此深入研究SOD1毒性发病复杂机制，探索与SOD1毒性关联的细胞非自主机制，阐明不同细胞类型在发病中的地位，对于延缓疾病发生、减慢进展的治疗措施的研究有十分重要的前景。

二、认识ALS疾病蛋白TDP-43及FUS，开展ALS发病机制新通道的研究

近年来ALS研究取得的关键进步是发现了致病蛋白TDP43及FUS。在以往研究的基础上，人们应用生化、免疫组织化学方法证实ALS及额颞叶痴呆-ALS（FTLD-ALS）的变性运动神经元内的泛素化包涵体为TDP-43蛋白，进一步的研究发现该蛋白存在于90% sALS患者的尸检脑和脊髓组织，因此认为TDP-43为ALS的疾病蛋白，泛素包涵体因此改名为TDP43包涵体。TDP-43是Ou等在研究HIV-1基因表达中发现的1个广泛表达的核调节蛋白，由414个氨基酸组成，具有2个RNA识别模体（RRMI、2），N端有核定位信号（NLS），C端有甘氨酸富集区，能结合DNA、RNA，穿梭于胞质与核内，有高度保守性，可调节转录、剪接、RNA加工、细胞凋亡、细胞分裂、mRNA的稳定，参与神经元完整性和可塑性调节，广泛分布于各种组织，定位于核内，神经系统内位于神经元、胶质细胞、树突，控制RNA转录的剪接。编码TDP43的基因TARDBP位于1号染色体，为一必须有的生存基因，在动物实验中发现TDP43完全缺失时胚胎不能存活，条件缺失时产后死亡，杂合的动物出现运动功能障碍，有明显的年龄依赖性，即早期不表现症状，老年后出现症状。目前已发现30个不同的TARDBP基凶突变，多累及甘氨酸富集区，但突变基因检出频率较低，fALS检出的频率只有3%-5%，sALS的频率为0.4%-1.5%，总的突变率为2.7%。

2009年研究者又发现ALS患者的TDP43包涵体内存在FUS蛋白。FUS蛋白最早是作为原癌基因融合成分从1个有染色体易位的脂肪肉瘤中分离的，系526个氨基酸组成的多功能DNA、RNA的结合蛋白，N末端有丝氨酸一酪氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺（SYGQ）富集区，有2个RGG重复、RRM、甘氨酸富集区、半胱氨酸锌指模体，C端有非经典的核定位信号区，在核内、胞质均有表达，可在胞内外穿梭，参与细胞增殖、DNA修复、RNA及miRNA加工、转运、转录调节和维持基因稳定性，可维持神经元的可塑性、树突完整性‘4j。编码FUS蛋白的基因位于染色体16q12，有15个外显子，基因突变在fALS中的发生频率为3%-5%，是仅次于SOD1的fALS亚组；但在sALS中发生频率仅为0.6%-0.7%。该基因目前已发现有35个突变，多为错义突变，大部分位于13-15外显子，编码精氨酸-甘氨酸-甘氨酸重复区及NLS区，导致NLS中断，核转运蛋白介导的入核途径损害，1/3突变位于编码SYGQ及甘氨酸富集区的3、5、6外显子，有报道称C端突变多见于fALS，3、5、6突变多见于sALS。

ALS相关的TDP43及FUS蛋白的发现是ALS研究的一个重大事件和转折点。由于大部分ALS患者存在TDP-43、FUS蛋白的累积，ALS被认为是一种蛋白病，成为有特殊蛋白聚集的变性病的新成员。含有TDP43及FUS的包涵体代表ALS存在RNA蛋白加工功能缺陷，只前已发现的ALS相关的基因中除TARDBP及FUS外还有4个与RNA处理基因（senataxin、anglogenin、危险因子enlongator protein 3、运动神经元生存基因）有关。由此启动、加速了变性病以RNA加工为方向的发病机制研究，即研究蛋白修饰，蛋白与蛋白、蛋白与RNA之间的相互作用，研究转录、转录后蛋白处理如剪接、mRNA稳定、转运、翻译和RNA降解，不仅能了解RNA代谢通道改变的原因和机制，也将继续发现更多的疾病蛋白，进一步阐明ALS的发病机制。