清胰汤对急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响

急性胰腺炎（AP）为临床常见病.病情凶险，常引起全身炎症反应综合征（SIRS），并最终导致多器官功能衰竭（MODS）。目前具体发病机制尚不明确，治疗仍以对症支持为主。因而探求AP发病机制对寻找有效的治疗方法意义重大。本研究观察清胰汤对AP大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响。

一、材料与方法

1.实验动物分组：54只SD大鼠由广东省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0002，雌雄不限，体重（200±10）g。按完全随机法分成对照组、AP组、清胰汤组。采用逆行胰胆管注射3%牛磺胆酸钠的方法建立AP模型。清胰汤组于建模后立刻予清胰汤1ml/100g体重灌胃，每12 h给药一次；对照组仅开腹翻动胰腺数次即关腹，以生理盐水替代灌胃。

2.血清淀粉酶、IL-1和TNF-α测定：血清淀粉酶测定采用人工碘比色法；血清IL-1和TNF-α检测采用ELISA方法。3。胰腺病理学检查及NF-κB p65检测：胰腺组织常规病理检查，盲法闷片，并根据Ozhan等标准评分。胞质和（或）胞核呈黄色或棕黄色为阳性。高倍镜下随机取5个视野，计阳性细胞数百分比及染色强度。阳性细胞散：＜5%0分，6% - 25%1分，26%-50%2分，51% - 75%3分，＞ 75%4分；无染色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕黄色3分。两评分乘积0-1分为（-），2-3分（+），4-5分（++），＞6分（+++）。

4.统计学处理：采用SPSS II.O统计软件处理。计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05为差异具有统计学意义。

二、结果

1.血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平：AP组和清胰汤组血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平均高于对照组；AP组血清淀粉酶水平于24h达到峰值，随后逐渐下降，予清胰汤治疗后，24 h和48 h血清淀粉酶明显降低，72 h后3组比较差异无统计学意义；清胰汤组血清IL-1和TNF-α较AP组明显降低，呈时效依赖性，以72 h下降最明显（表1）。

表1 各组血清淀粉酶、IL-1和TNF-α变化（±s）



注：与对照组比较，aP（0.05；与AP组比较，bp ＜0.05

2.胰腺病理组织学变化：对照组胰腺组织未见病理改变（图1a）；AP组大鼠胰腺可见出血，坏死，大量炎细胞浸润，腺泡结构模糊，部分腺泡胞核溶解或消失，残余腺泡肿胀，间质水肿（图1b）；而清胰汤组胰腺组织病理改变较AP组减轻（图1c）。各组胰腺病理评分见表2。



图1 对照组（a）、AP组（b）和清胰汤组（c）大鼠胰腺组织病理改变（HE ×200）

表2 各组胰腺病理评分（±s）



注：与对照组比较，aP ＜0.05；与AP组比较，bp＜0.05

3.胰腺NF-κB p65蛋白表达：对照组胰腺组织NF-κB p65微量表达，主要见于细胞质，呈浅黄色（图2a）；AP组备时间点NF-κB F65表达增强，呈棕黄色，部分细胞核也有表达（图2b）；清胰汤组胰腺腺泡染色较AP变浅，胰腺NF-κB p65免疫组化积分较AP明显降低（图2c，表3）。



图2 对照组（a）、AP组（b）和清胰汤组（c）胰腺NF-κB表达（×200）

表3 各组胰腺NF-κB p61免疫组化积分（±s）



注：与AP组比较，aP＜0.05

讨论 AP病程中氧自由基、白介素、TNF等细胞因子大量产生，并易导致SIRS和MODS。清胰汤为传统组方，具有通里攻下，减少肠源性感染与内毒素血症；活血化瘀，改善微循环.减轻各器官的缺血、缺氧，减少氧自由基的产生；清除氧自由基；抑制体内各种炎症因子的产生；诱导器官细胞凋亡，从而减轻器官坏死程度等作用。本研究结果显示，应用清胰汤治疗后AP大鼠各种氧化应激因子、炎症因子明显降低，器官损伤程度改善。

研究发现，TNF-α、IL-1等多种细胞因子及黏附分子在基因多肽水平上受到NF-κB p65调节。活化的NF-κB p65可单独或与其他转录因子协同参与上述炎症因子基因的诱导表达，在细胞因子瀑布样级联反应中起中心作用。在AP发生早期，多个器官可检测到NF-κB p65高表达，并参与多器官的病理损伤。应用NF-κB p65活化选择性抑制荆NBD，可选择性靶向抑制NF-κB，明显减轻AP大鼠胰腺、肺等器官损伤。近年研究发现，活性氧ROS是激活NF-κB的重要中介分子，因此抗氧化剂作为NF-κB抑制剂被深入研究。

本实验再次验证了清胰汤在AP模型大鼠中显示出良好的治疗效果。与AP组比较，清胰汤24 h和48h血清淀粉酶明显降低，72 h接近正常水平，提示清胰汤能有效降低血清淀粉酶。炎症介质TNF-α、IL-1在AP发生、发展过程中发挥着重要作用，本研究发现二者升高明显。应用清胰汤治疗后大鼠血清TNF-α、IL-1水平于48 h和72 h较AP组下降明显，提示清胰汤可抑制炎症反应，减少炎症介质的产生和释放。奉结果显示，AP大鼠胰腺NF-κBp65表达在建模后有不同程度升高，与血清中TNF-α、IL-1升高及胰腺病理损伤相平行，应用清胰汤灌胃治疗，降低了血清TNF-α、IL-1水平，并下调胰腺NF-κB p65的表达，改善其病理损伤。

综上所述，中药清胰汤对AP的治疗是通过多靶点作用实现的，其可能机制是通过抑制炎症通路中炎症相关蛋白的表达，从而达到保护器官目的。本研究得出，AP发生、发展涉及NF-κB p65等炎症相关因子的激活，产生并释放过度炎症介质介导过度炎症反应造成各器官的损伤；清胰汤可抑制AP大鼠体内过度炎症反应，降低TNF-α，IL-1水平，下诃胰腺NF-κBp65表达，从而起到保护胰腺的治疗效果。